Farelerde grip A Virüs Enfeksiyonu Sırasında T Foliküler Yardımcı Hücrelerin ve Germinal Merkez Yanıtının Değerlendirilmesi
Summary
Bu makalede, influenza virüs enfeksiyonunun fare modelinde Tfh ve GC B yanıtını değerlendirme protokolleri açıklanmaktadır.
Abstract
T Foliküler Yardımcı (Tfh) hücreleri, germinal merkez (GC) gelişimi ve yüksek benzeşimli antikorların üretimi için yardım sağlama konusunda uzmanlaşmış bağımsız bir CD4+ T hücre alt kümesidir. grip virüsü enfeksiyonunda, etkili virüs eradikasyonunu kolaylaştırmak için sağlam Tfh ve GC B hücre yanıtları indüklenir, bu da Tfh ile ilişkili çalışma için nitelikli bir fare modeli sağlar. Bu yazıda, farelerde influenza virüsü enfeksiyonu sırasında temel Tfh ilişkili immün yanıtın tespitinde protokolleri açıkladık. Bu protokoller şunlardır: influenza virüsünün intranazal infülasyonu; akış sitometrisi boyama ve poliklonal ve antijene özgü Tfh hücrelerinin, GC B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin analizi; GC’lerin immünofluoresans tespiti; serumda influenza virüsüne özgü antikorun enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA). Bu tahliller temel olarak influenza virüs enfeksiyonunda Tfh hücrelerinin farklılaşmasını ve işlevini ölçerek farklılaşma mekanizması ve manipülasyon stratejisinin aydınlatıcı çalışmalarında yardımcı olunmaktadır.
Introduction
Son on yılda, germinal center (GC) B gelişimindeki temel rolleri için yeni tanımlanan CD4+ T hücre alt kümesi olan Tfh hücre alt kümesi üzerinde çok sayıda çalışma odaklanmıştır. Esas olarak bir gen represörü olarak kabul edilen B hücreli lenfoma 6 (Bcl6), Bcl6’nın ektopik ekspresyonunun Tfh farklılaşmasına yol açmanın yeterli olduğu ve Bcl6’nın eksikliğinin kaybolan Tfh farklılaşması 1 ,2,3ile sonuçladığı kanıtı için Tfh hücrelerinin soyu belirleyici faktörüdür. Diğer CD4+ T yardımcı alt kümelerinin aksine, iltihap bölgelerine göç ederek efektör işlevlerini yerine getirirken, Tfh hücreleri B hücresi yardımını esas olarak dalak ve lenf düğümünün B hücre foliküler bölgesinde sağlar. Ortak uyarıcı moleküller ICOS ve CD40L, Tfh ve GC B hücreleri arasındaki etkileşimde önemli roller oynar. Tfh farklılaşması sırasında, ICOS konyak B hücrelerinden gerekli sinyalleri iletir ve ayrıca B hücre bölgesi lokalizasyonu4,5için seyirci B hücrelerinden geçiş sinyalleri alan bir reseptör görevi görür. CD40L, B hücrelerinin çoğalması ve sağkalım için Tfh hücrelerinden gelen sinyallerin arabulucusudur6. CD40L ile benzer rolü oynayan bir diğer faktör, esas olarak Tfh hücreleri tarafından salgılanan sitokin IL21’dir. IL21, GC B hücrelerinin gelişimini ve yüksek benzeşimli antikorların üretimini doğrudan düzenler, ancak Tfh farklılaşmasındaki rolü hala tartışmalıdır7,8. Akış sitometrisi analizinde Tfh hücrelerinin tanımlanmasında en sık kullanılan PD-1 ve CXCR5 de bu alt kümenin farklılaşmasında ve işlevinde önemli roller oynamaktadır. CXCR5, B hücre foliküler kemokinin reseptörüdür ve B hücre foliküllerinde Tfh hücrelerinin lokalizasyonuna aracılık eder9. PD-1 artık sadece foliküler rehberlik işlevine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda GC B hücrelerinin benzeşim olgunlaşması sürecinde kritik sinyalleri iletir10. Bu bulgulara dayanarak, bu moleküllerin ekspresyonunu değerlendirmek temel olarak Tfh hücrelerinin olgunlaşmasını ve işlevini yansıtabilir.
GC, sekonder lenfoid organlarda indüklenmiş geçici bir mikroanatomik yapıdır ve Tfh hücrelerine oldukça bağımlıdır, bu nedenle Tfh yanıtını değerlendirmek için mükemmel bir okumadır. GC’de, sitokinler ve ko-uyarıcı moleküller tarafından aracılık edilen sinyalleri aldıktan sonra, B hücreleri yüksek benzeşimli antikorlar oluşturmak için sınıf değiştirme ve somatik hipermütasyona tabidir11. Diferansiyel antikor sınıfı anahtarlama, IL4 ve IL21’in IgG1 sınıfının değiştirilmesine neden olduğu diferansiyel sitokin nişinde gerçekleşirken, IFNφ IgG2 sınıfının12’yegeçmesine neden olur. Plazma hücreleri salgılanan antikorların üreticileridir ve ölümcül olarak farklılaştırılmış hücrelerdir. Tfh hücreleri gibi, GC’deki B hücrelerinin gelişimi de birçok önemli molekülün dinamik ekspresykülü ile ilişkilidir. Mevcut çalışmaya dayanarak, GC B hücreleri B220+PNA+Fas+ veya B220+GL7+Fas+ hücreler ve plazma hücreleri olarak tanımlanabilir, öncüllerine kıyasla, B220’nin downregulate ekspresyolu ve upregulate CD138 ifadesi13. Dahası, bu özelliklerin her ikisi de akış sitometrisinde ve immünofluoresans analizinde tespit edilebilir, böylece GC yanıtının uygun değerlendirmesidir.
Grip virüsü enfeksiyonunda sağlam hücresel ve humoral yanıtlar indüklenir, Tfh ve Th1 hücreleri CD4+ T hücre yanıtı14‘e hakimdir, bu da onu Tfh hücreleri farklılaşma çalışması için mükemmel bir model haline getirir. Influenza A/Porto Riko/8/34 Fareye uyarlanmış bir suş olan H1N1 (PR8), bu çalışmada sıklıkla14,15,16. Burada, influenza virüsü enfeksiyonunda Tfh çalışması ile ilgili tahlillerin bazı temel protokollerini açıklıyoruz: 1) PR8 virüsünün intranazal infülasyonu; 2) antijene özgü Tfh hücreleri, GC B ve plazma hücreleri ve akış sitometrisi ile IL21 tespiti; 3) GC’nin histolojik görselleştirilmesi; 4) ELISA ile serumda antijene özgü antikor titresinin tespiti. Bu protokoller, Tfh ile ilişkili çalışmada yeni araştırmacılar için gerekli teknikleri sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yüksek benzeşimli antikorlar üretmek için B hücre yardımı sağlamada özel roller nedeniyle, Tfh hücreleri aşı tasarımı için yeni stratejiler sağlamak için farklılaşma ve manipülasyon mekanizmalarında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. İnfluenza virüsü enfeksiyonu güçlü Tfh ve GC B hücreleri yanıtlarına neden olarak bu araştırma alanı için uygun bir modeldir. Bu yazıda influenza virüsü enfeksiyonunun intranazal aşılama, Tfh ilişkili yanıtın akış sitometrisi, immünoresans ve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Debi sitometri tesisi, ABSL2 tesisi ve Şanghay Institut Pasteur SPF hayvan tesisi personeline teknik yardımları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklendi: Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelikli Araştırma Programı (XDB29030103), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFA0502202), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31570886).
Materials
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
