Quantificação da adesão celular tumoral em crioseções de nó linfático
Summary
Aqui, descrevemos um método simples e barato que permite a quantificação de células tumorais adesivos para genimosgenas de nódulos linfáticos (LN). As células tumorais aderentes de LN são prontamente identificadas pela microscopia leve e confirmadas por um método baseado em fluorescência, dando um índice de adesão que revela a afinidade de ligação celular tumoral ao parenchyma lN.
Abstract
Os linfonodos drenantes de tumores (LNs) não são apenas filtros de resíduos produzidos pelo tumor. São um dos locais regionais mais comuns de residência provisória de células tumorais disseminadas em pacientes com diferentes tipos de câncer. A detecção dessas células tumorais residentes em LN é um importante biomarcador associado ao mau prognóstico e decisões de terapia adjuvante. Modelos recentes de camundongos indicaram que as células tumorais residentes em LN podem ser uma fonte substancial de células malignas para metástases distantes. A capacidade de quantificar a adesividade das células tumorais para o parenchyma lN é um indicador crítico em pesquisas experimentais que se concentra na identificação de genes ou sinalizando caminhos relevantes para a disseminação linfática/metastática. Como as LNs são estruturas 3D complexas com uma variedade de aparências e composições em seções teciduais dependendo do plano de seção, suas matrizes são difíceis de replicar experimentalmente in vitro de forma totalmente controlada. Aqui, descrevemos um método simples e barato que permite a quantificação de células tumorais adesivos para crioseções LN. Usando seções serial da mesma LN, adaptamos o método clássico desenvolvido pela Brodt para usar rótulos não radioativos e contar diretamente o número de células tumorais aderente por área de superfície LN. As células tumorais aderentes de LN são prontamente identificadas pela microscopia leve e confirmadas por um método baseado em fluorescência, dando um índice de adesão que revela a afinidade de ligação celular ao parenchyma lN, que é evidência sugestiva de alterações moleculares na ligação de afinidade dos integrins aos seus ln-ligands correlacionados.
Introduction
A metástase do câncer é a principal razão para a falha no tratamento e o aspecto dominante de risco de vida do câncer. Como postulou há 130 anos, a disseminação metastática resulta quando uma elite das células tumorais disseminadas (DTCs, as “sementes”) adquirem habilidades biológicas específicas que lhes permitem escapar dos locais primários e estabelecer crescimento maligno em locais distantes (o “solo”)1. Recentemente, surgiram diversos conceitos novos sobre as relações “sementes e solo”, como a indução de nichos pré-metastáticos (conceitualizado como um “solo fértil” necessário para que “sementes” prosperassem), a auto-semeagem de tumores primários por DTCs, a dormência da “semente” em órgãos secundários e o modelo de progressão paralela da metástase2.
Para a maioria das malignidades sólidas, os DTCs podem residir e serem detectados em muitos órgãos mesenquitais, como medula óssea e linfonodos (LNs) em pacientes com ou sem evidências de metástase clínica. Como as LNs drenantes de tumores são o primeiro local da disseminação regional de DTCs, o status de LN é um indicador prognóstico importante e muitas vezes está associado às decisões de terapia adjuvante3. Para alguns tipos de tumores, a correlação entre o estado de LN e os piores desfechos é forte, incluindo câncer de cabeça e pescoço4,5, mama6,próstata7,pulmão8,gástrico9,colorretal10,11 e câncer de tireoide12.
As LNs são pequenos órgãos ovoids do sistema linfático, que são cobertos com células reticulares e fechados com vasos linfáticos. Esses órgãos são absolutamente necessários para o funcionamento do sistema imunológico13. As LNs atuam como plataformas de atraidores para células de circulação imunológicas, unindo os linfócitos e células presentes a antígenos14. No entanto, as LNs também atraem células tumorais circulantes. Ao longo de décadas, as LNs foram retratadas como rotas passivas de transporte para células tumorais metastáticas. No entanto, estudos recentes indicaram que as células tumorais também podem ser guiadas para AsLs por causa de sugestões quimiotática (quimiotática) e/ou haptotática (elementos de matriz extracelular) secretadas pelo endotelo linfático15. Como exemplos, a superexpressão do receptor CCR7 em células tumorais facilita a orientação de células de melanoma metastático para lNs16. Além disso, as proteínas de LN extracelulares fornecem um andaime adesivo para o recrutamento e sobrevivência das células tumorais circulantes17. De fato, as LNs que drenam tumores fornecem solo fértil para a semeagem de DTCs, que podem ser mantidos em estados proliferativos ou adormecidos por sinais microambientais ln específicos18. O destino final desses DTCs residentes em LN é controverso; alguns trabalhos sugerem que essas células são indicadores passivos de progressão metastática19, enquanto outras propõem que são mais prováveis fundadores de resistência (por locais primários de auto-semeaduras) e/ou agem como reservatórios celulares para metástases (espalhando “sementes” para o crescimento do câncer terciário)20,21. Recentemente, usando modelos pré-clínicos, foi demonstrado que uma fração desses DTCs residentes em LN invadiu ativamente os vasos sanguíneos, entrou na circulação sanguínea e colonizou os pulmões21.
Considerando que a presença de células cancerígenas em LNs é um marcador para a agressividade e a intrusividade do câncer, neste estudo, otimizamos um método clássico desenvolvido pela Brodt22 para medir quantitativamente a adesão celular tumoral a LNs in vitro. O uso de um ensaio baseado em fluorescência nos permitiu desenvolver um protocolo de baixo custo, rápido, sensível e ambientalmente amigável (não radioativo) para a detecção de alterações adesivos entre células tumorais e crioseções de LN. Usando as células cancerígenas de mama MCF-7 expressando diferentes níveis de expressão genética NDRG4 e seções congeladas de ratos LN para exemplificar o método, mostramos que este protocolo permitiu uma boa correlação entre a adesão celular tumoral a LNs in vitro e metástase LN observada em pacientes com câncer de mama24.
Protocol
Representative Results
Discussion
A disseminação do sistema linfático de células cancerosas requer uma variedade de eventos complexos orientados por células. Eles iniciam com o desprendimento celular do tumor primário e a remodelação da arquitetura de matriz extracelular (ECM), e são apoiados por quimotáxis persistentes e migração ativa através da linfática afetiva a caminho das LNs sentinelas. Se as células cancerígenas aderirem e sobreviverem em LNs, elas podem facilmente se espalhar para outros órgãos secundários. Aqui descrevemos u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Dra. Este trabalho contou com o apoio de bolsas da FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (2016/07463-4) e do Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer (LICR).
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P., Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
