Quantificazione dell'adesione delle cellule tumorali nelle Criosezioni del linfonodo
Summary
Qui, descriviamo un metodo semplice ed economico che permette la quantificazione delle cellule tumorali adesive alle criosezioni dei linfonodi (LN). Le cellule tumorali aderenti a LN sono facilmente identificabili dalla microscopia leggera e confermate da un metodo basato sulla fluorescenza, dando un indice di adesione che rivela l’affinità di legame delle cellule tumorali al parenchyma LN.
Abstract
I linfonodi che drenano di tumore (LN) non sono solo filtri di rifiuti prodotti da tumore. Sono uno dei siti regionali più comuni di residenza provvisoria di cellule tumorali diffuse in pazienti con diversi tipi di cancro. La rilevazione di queste cellule tumorali che risiedano da LN è un importante biomarcatore associato a prognosi infaminante e decisioni di terapia adiuvante. Recenti modelli murini hanno indicato che le cellule tumorali che risiedivano l’LN potrebbero essere una fonte sostanziale di cellule maligne per metastasi distanti. La capacità di quantificare l’adiposisia delle cellule tumorali al parenchyma LN è un indicatore critico nella ricerca sperimentale che si concentra sull’identificazione dei geni o sui percorsi di segnalazione rilevanti per la diffusione linfatica/metastatica. Poiché le LN sono strutture 3D complesse con una varietà di aspetti e composizioni in sezioni di tessuto a seconda del piano di sezione, le loro matrici sono difficili da replicare sperimentalmente in vitro in modo completamente controllato. Qui, descriviamo un metodo semplice ed economico che permette la quantificazione delle cellule tumorali adesive alle criosezioni LN. Utilizzando sezioni seriali dello stesso LN, adattiamo il metodo classico sviluppato da Brodt per utilizzare etichette non radioattive e contiamo direttamente il numero di cellule tumorali aderenti per superficie LN. Le cellule tumorali aderenti a LN sono facilmente identificabili mediante microscopia leggera e confermate da un metodo basato sulla fluorescenza, fornendo un indice di adesione che rivela l’affinità di legame cellulare con il parenchyma LN, che è una prova suggestiva di alterazioni molecolari nel legame di affinità delle integrine alle loro legature LN correlate.
Introduction
La metastasi del cancro è la ragione principale per il fallimento del trattamento e l’aspetto dominante pericoloso per la vita del cancro. Come postulato 130 anni fa, la diffusione metastatica si traduce quando un’élite di cellule tumorali diffuse (DTC, i “semi”) acquisisce specifiche abilità biologiche che permettono loro di eludere i siti primari e stabilire una crescita maligna in siti lontani (il “suolo”)1. Recentemente, sono emersi diversi nuovi concetti riguardanti le relazioni “seme e suolo”, come l’induzione di nicchie premetastatiche (concettualizzate come un “terreno fertile” necessario per i “semi” per prosperare), l’auto-semina dei tumori primari da parte della DC, la dormancy “seme” agli organi secondari e il modello di progressione parallela della metastasi2 .
Per la maggior parte delle neoplasie solide, le DTC possono risiedere ed essere rilevate in molti organi mesenchyli, come il midollo osseo e i linfonodi (LN) in pazienti con o senza evidenza di metastasi cliniche. Poiché le LN che drenano i tumori sono la prima posizione della diffusione regionale dei DTC, lo stato di LN è un importante indicatore prognostico ed è spesso associato alle decisioni terapeutiche adiuvanti3. Per alcuni tipi di tumore, la correlazione tra lo stato di LN e gli esiti peggiori è forte, tra cui testa e collo4,5, seno6, prostata7, polmone8, gastrico9, colonctal10,11 e tumori tiroidei12.
Le LN sono piccoli organi ovoidi del sistema linfatico, che sono coperti con cellule reticolari e racchiusi con vasi linfatici. Questi organi sono assolutamente necessari per il funzionamento del sistema immunitario13. Le LN fungono da piattaforme attrattiva per le cellule circolanti immunitarie, portando insieme i linfociti e le cellule che presentano antigeni14. Tuttavia, le LN attraggono anche le cellule tumorali circolanti. Nel corso dei decenni, le LN sono state raffigurate come vie passive di trasporto per le cellule tumorali metastatiche. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che le cellule tumorali possono anche essere guidate verso Le LN da chemiotattiche (chemiochine) e/o aptotattiche (elementi di matrice extracellulari) spunti secreti dall’endotelio linfatico15. Ad esempio, la sovraespressione del recettore CCR7 nelle cellule tumorali facilita la guida delle cellule del melanoma metastatico verso i LN16che drenano il tumore . Inoltre, le proteine LN extracellulari forniscono uno scaffold adesivo per il reclutamento e la sopravvivenza delle cellule tumorali circolanti17. Infatti, le LN che drenano i tumori forniscono terreno fertile per la semina di DTC, che può essere mantenuta in stati proliferanti o dombetari da specifici segnali microambientali LN18. Il destino finale di questi DTC residenti da LN è controverso; alcune opere suggeriscono che queste cellule sono indicatori passivi di progressione metastatica19, mentre altri propongono che sono più probabili fondatori di resistenza (da siti primari auto-semina) e/o agiscono come serbatoi cellulari per metastasi (diffondendo “semi” per la crescita del cancro terziario)20,21. Recentemente, utilizzando modelli preclinici, è stato dimostrato che una frazione di questi DTC residenti da LN ha invaso attivamente i vasi sanguigni, è entrata nella circolazione sanguigna e ha colonizzato i polmoni21.
Considerando che la presenza di cellule tumorali nelle LN è un indicatore per l’aggressività e l’invasività del cancro, in questo studio, abbiamo ottimizzato un metodo classico sviluppato da Brodt22 per misurare quantitativamente l’adesione delle cellule tumorali alle LN in vitro. L’uso di un saggio basato sulla fluorescenza ci ha permesso di sviluppare un protocollo a basso costo, rapido, sensibile e rispettoso dell’ambiente (non radioattivo) per il rilevamento di alterazioni adesive tra cellule tumorali e criosezioni LN. Utilizzando le cellule MCF-7 di cancro al seno che esprimono diversi livelli di espressione genica NDRG4 e sezioni congelate di LN di ratto per esemplificare il metodo, abbiamo dimostrato che questo protocollo ha permesso una buona correlazione tra l’adesione delle cellule tumorali alle LN in vitro e la metastasi LN osservata nei pazienti affetti da cancro al seno24.
Protocol
Representative Results
Discussion
La diffusione del sistema linfatico delle cellule tumorali richiede una varietà di eventi complessi basati sulle cellule. Iniziano con il distacco cellulare dal tumore primario e il rimodellamento dell’architettura a matrice extracellulare (ECM), e sono supportati da chemiotassi persistenti e migrazione attiva attraverso la linfatica afferente in rotta verso le LN sentinella. Se le cellule tumorali aderiscono e sopravvivono in LN, possono facilmente diffondersi ad altri organi secondari. Qui descriviamo un metodo sempli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Dr. Rosana De Lima Pagano e Ana Carolina Pinheiro Campos per l’assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di: FAPESP – San Paolo Research Foundation (2016/07463-4) e Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
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