Antibiotikum Dereplication med hjälp av antibiotikaresistens plattform
Summary
Vi beskriver en plattform som använder ett bibliotek av isogena antibiotikaresistenta Escherichia coli för dereplication av antibiotika. Identiteten hos ett antibiotikum som produceras av bakterier eller svampar kan härledas genom tillväxten av E. coli som uttrycker dess respektive motstånds gen. Denna plattform är ekonomiskt effektiv och tidseffektiv.
Abstract
En av de största utmaningarna i sökandet efter nya antibiotika från naturliga produkt extrakt är återupptäckten av gemensamma föreningar. För att lösa denna utmaning, dereplication, som är processen för att identifiera kända föreningar, utförs på prover av intresse. Metoder för dereplication såsom analytisk separation följt av masspektrometri är tidskrävande och resurskrävande. För att förbättra dereplication processen har vi utvecklat antibiotikaresistens plattform (ARP). ARP är ett bibliotek med cirka 100 antibiotikaresistens gener som har varit individuellt klonade till Escherichia coli. Denna stam samling har många tillämpningar, inklusive en kostnadseffektiv och facile metod för antibiotika dereplication. Processen innebär jäsning av antibiotika-producerande mikrober på ytan av rektangulära petriskålar som innehåller fast medium, vilket möjliggör utsöndring och diffusion av sekundära metaboliter genom mediet. Efter en 6 dagars fermenterings period, den mikrobiella biomassan avlägsnas, och en tunn agar-overlay läggs till petriskål för att skapa en slät yta och möjliggöra tillväxt av E. coli indikatorn stammar. Vår samling av ARP stammar fästs sedan på ytan av antibiotikum som innehåller petriskål. Plattan är nästa inkuberas över natten för att möjliggöra E. coli tillväxt på ytan av överlägget. Endast stammar som innehåller resistens mot ett specifikt antibiotikum (eller klass) växer på denna yta vilket möjliggör snabb identifiering av den producerade substansen. Denna metod har använts med framgång för att identifiera tillverkare av kända antibiotika och som ett sätt att fastställa vilka som producerar nya föreningar.
Introduction
Sedan upptäckten av penicillin i 1928, naturliga produkter som härrör från miljömikroorganismer har visat sig vara en rik källa av antimikrobiella föreningar1. Cirka 80% av naturliga produkt antibiotika härrör från bakterier av släktet Streptomyces och andra actinomycetes, medan resterande 20% produceras av svamparter1. Några av de vanligaste antibiotiska ställningar som används på kliniken som β-lactams, tetracykliner, Rifamycins och aminoglykosider, var ursprungligen isolerade från mikrober2. Men på grund av uppkomsten av Multidrug resistenta (Mdr) bakterier, vår nuvarande panel av antibiotika har blivit mindre effektiv i behandling3,4. Dessa inkluderar “ESKAPE”-patogener (dvs. vankomycinresistenta enterokocker och β-laktamresistenta Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniioch Enterobacter SP.), som är en delmängd av bakterier som bedöms vara förknippade med den högsta risken av ett antal stora folkhälsomyndigheter som Världshälsoorganisationen3,4,5. Uppkomsten och den globala spridningen av dessa Mdr patogener resulterar i ett konstant behov av nya antibiotika3,4,5. Beklagligt nog har de senaste två decennierna visat att upptäckten av nya antibiotika från mikrobiella källor blir allt svårare6. Aktuella metoder för läkemedels upptäckt omfattar hög genomströmning screening av bioaktiva föreningar, inklusive naturliga produkter extrahera bibliotek, vilket gör att tusentals utdrag som ska testas vid en given tidpunkt2. Men när antimikrobiell aktivitet upptäcks, är nästa steg att analysera innehållet i rå extrakt för att identifiera den aktiva komponenten och eliminera de som innehåller kända eller överflödiga föreningar7,8. Denna process, kallad dereplication, är avgörande för att förhindra och/eller avsevärt minska den tid som ägnas åt återupptäckten av kända antibiotika7,9. Även om ett nödvändigt steg i naturliga produkt Drug discovery, dereplication är notoriskt mödosam och resurskrävande10.
Ända sedan Beutler et al. först myntade termen “dereplication”, omfattande ansträngningar har gjorts för att utveckla innovativa strategier för snabb identifiering av kända antibiotika11,12. I dag omfattar de vanligaste verktygen för dereplication analytiska kromatografiska system såsom högpresterande vätskekromatografi, masspektrometri och nukleära magnetresonans-baserade detektionsmetoder11,13. Tyvärr, var och en av dessa metoder kräver användning av dyr analytisk utrustning och sofistikerad data tolkning.
I ett försök att utveckla en dereplication metod som snabbt kan utföras utan specialiserad utrustning, etablerade vi antibiotikaresistens plattform (ARP)10. ARP kan användas för upptäckten av antibiotika adjuvans, profilering av nya antibiotika föreningar mot kända resistensmekanismer, och dereplication av kända antibiotika i extrakt som härrör från Actinobacteria och andra mikrober. Här fokuserar vi på dess tillämpning i antibiotika dereplication. ARP använder ett bibliotek av isogena Escherichia coli -stammar som uttrycker individuella motstånds gener som är effektiva mot de vanligast återupptäckta antibiotika14,15. När e. coli biblioteket odlas i närvaro av en sekundär metabolitproducerande organism, identiteten hos föreningen kan härledas genom tillväxten av e. coli stammar som uttrycker dess associerade resistens gen10. När ARP rapporterades första gången bestod biblioteket av > 40 gener som ger resistens mot 16 antibiotika klasser. Den ursprungliga dereplication mallen utformades för att omfatta en delmängd av resistens gener per antibiotika klass för att ge information om antibiotika underklass under dereplication processen. Idag består ARP av > 90 gener som ger resistens mot 18 antibiotika klasser. Med hjälp av vår omfattande samling av resistensgener, en sekundär dereplication mall har utvecklats och är känd som den minimala antibiotikaresistens plattform (MARP). Denna mall skapades för att eliminera genredundans och att helt enkelt ge information om den allmänna antibiotika klass som en dereplicated metabolit är relaterat till. Dessutom, den MARP mallen besitter både vildtyp och en hyperpermeable/efflux bristfällig stam av e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δbambδTolc), jämfört med den ursprungliga inkarnationen av ARP, som endast utnyttjar den hyperpermeabla stammen. Denna unika aspekt skapar ytterligare fenotyper under dereplication, indikerar en föreningar förmåga att korsa det yttre membranet av gramnegativa bakterier. Här beskriver vi ett robust protokoll som ska följas vid borttagande av antingen ARP och/eller MARP, belysa de mest kritiska steg som ska följas, och diskutera de olika möjliga resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som beskrivs ovan kan tillämpas på både upptäckten av nya antimikrobiella substanser och adjuvans som kan användas tillsammans med befintliga antibiotika för att rädda sin verksamhet. Plattformen utnyttjar den höga substrat specificiteten hos resistensmekanismer och deras besläktat antibiotika, för att dereplicate föreningar inom rå naturliga produkt extrakt. Även om den tid som krävs för dereplication plattor som skall förberedas är lång (~ 2 veckor), den dereplication processen i sig är…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Wright Lab som hänför sig till ARP/MARP stöddes av Ontarios forskningsfond och kanadensiska institut of Health Research Grant (FRN-148463). Vi skulle vilja erkänna Sommer Chou för att bistå i utbyggnaden och organisationen av ARP-biblioteket.
Materials
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
