בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר
Summary
הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לזהות מלכודת מקרופאג מסחטות (MET) ייצור בתרבות התא החי באמצעות מיקרוסקופ וכתמים פלואורסצנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר כדי לבחון סמנים מסוימים של החלבון נפגשו על-ידי כתמים immunofluorescence.
Abstract
שחרורו של מלכודות מסחטות (ETs) על ידי נויטרופילים זוהה כגורם תורם להתפתחות של מחלות הקשורות לדלקת כרונית. נויטרופילים מורכב מרשת של DNA, חלבונים היסטון, וחלבונים שונים של הגרניט (כלומר, myeloperoxidase, elastase, ו-צנתור G). תאים חיסוניים אחרים, כולל מקרופאגים, יכולים גם לייצר ETs; עם זאת, עד כמה זה קורה בvivo והאם מקרופאג מלכודות לחילוץ (מטס) לשחק תפקיד במנגנונים פתולוגיים לא נבדק בפרוטרוט. כדי להבין טוב יותר את התפקיד של גרורות בפתווגיות דלקתיות, פרוטוקול פותחה לצורך ויזואליזציה שחרור MET מקרופאגים האנושי העיקרי בתוך מבחנה, אשר ניתן גם לנצל בניסויים immunofluorescence. זה מאפשר אפיון נוסף של המבנים האלה ואת ההשוואה שלהם ETs שוחרר מ נויטרופילים. מקרופאגים של האדם מונוציט הנגזר (HMDM) לייצר גרורות בעת חשיפה גירויים דלקתיים שונים בעקבות בידול ל-M1 pro-הפנוטיפים דלקתיים. שחרורו של מטס יכול להיות מדמיין על ידי מיקרוסקופ באמצעות כתם ירוק הגרעין חומצה פלואורסצנטי כי הוא מיועד לחיות תאים (g., בדיקת רעלים ירוק). השימוש של מקרופאגים ראשוניים מבודדים, כגון HMDM, הוא יתרון במידול באירועים דלקתיים vivo הרלוונטיים יישומים קליניים פוטנציאליים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד שחרור MET מתוך קווי מונוציט האדם התאים (למשל, THP-1) בעקבות בידול לתוך מקרופאגים עם האצטטים myristate מקרופאג או אחרים תא קווי (g., מקרופאג murine כמו J774A. 1 תאים).
Introduction
שחרורו של ETs מ נויטרופילים זוהה לראשונה כתגובה חיסונית מולדת המופעל על ידי זיהום חיידקי1. הם מורכבים השדרה DNA אשר שונים חלבונים הגרניט עם תכונות אנטי בקטריאלי מאוגדים, כולל נויטרופילים elastase ו myeloperoxidase2. התפקיד העיקרי של נויטרופילים (רשתות) היא ללכוד פתוגנים ולהקל על חיסול שלהם3. עם זאת, בנוסף לתפקיד המגן של ETs בהגנה החיסונית, מספר גדל והולך של מחקרים גילו גם תפקיד בפתוגנזה מחלה, במיוחד במהלך התפתחות של מחלות מונחה דלקות (כלומר, דלקת מפרקים שגרונית ו טרשת עורקים4). שחרורו של ETs יכול להיות מופעלות על ידי ציטוקינים pro-דלקתיות שונים כולל אינטרלויקין 8 (IL-8) ו נמק גורם הגידול אלפא (tnfα)5,6, ואת הצטברות מקומי של ETs יכול להגביר את הנזק לרקמות ולעורר תגובה הפרו דלקתית7. לדוגמה, ETs היו מעורבים כמו לשחק תפקיד סיבתי בפיתוח טרשת עורקים8, קידום פקקת9, וחיזוי הסיכון וכלי דם10.
עכשיו הוא מוכר כי בנוסף נויטרופילים, תאים חיסוניים אחרים (כלומר, התורן תאים, אאוזיפרלס, ו מקרופאגים) יכול גם לשחרר את האור על חשיפה לחיידקים או גירוי פרו-דלקתי11,12. זה עשוי להיות משמעותי במיוחד במקרה של מקרופאגים, בהתחשב תפקיד המפתח שלהם בפיתוח, רגולציה, והרזולוציה של מחלות דלקתיות כרוניות. לכן, חשוב להשיג הבנה גדולה יותר של הקשר הפוטנציאלי בין שחרור ET מקרופאגים ופיתוח דלקת מחלות הקשורות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מטס ורשתות בפלאק טרשת עורקים אנושיים שלמים ומאורגנים בתרובי13. באופן דומה, המטס היו מעורבים בנהיגה פציעה בכליות באמצעות התקנה של תגובות דלקתיות14. עם זאת, בניגוד נויטרופילים, יש נתונים מוגבלים על מנגנוני היווצרות MET מקרופאגים. מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות האדם מודלים מחוץ לתחום של היווצרות MET להראות כמה הבדלים המסלולים המעורבים בכל סוג תא (כלומר, לגבי העדר הציטרין של היסטון עם מקרופאגים)6. עם זאת, חלק הראו כי מהדורת NET יכול להתרחש גם בהעדר האוקירורולציה15.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה פשוטה וישירה להערכת שחרור MET במודל מקרופאג רלוונטי קלינית. ישנם מספר שונים של מודלים מקרופאג cell מחוץ לתחום ששימשו לחקר מטס (כלומר, קו התאים האנושי THP-1 מונוציט וקווי התאים השונים murine מקרופאג)16. ישנן מספר מגבלות המשויכות למודלים אלה. לדוגמה, הבידול של THP-1 מונוציטים מקרופאגים בדרך כלל דורש צעד לקרקע, כגון תוספת של מיבריא אצטט myristate (PMA), אשר עצמו מפעיל את החלבון קינאז C (PKC) התלויים שבילים. תהליך זה ידוע להפעיל את שחרור ET4 ותוצאות שחרור בסיס נמוך הבזמ thp-1 תאים. מחקרים אחרים הדגישו כמה הבדלים ביו פעילות ותגובות דלקתיות רכוב על ידי מקרופאגים ב vivo לעומת PMA מטופלים THP-1 תאים17.
באופן דומה, את ההתנהגות ואת התגובות דלקתיות של קווי מורטין מקרופאג שונים כמו הקווים אינם מייצגים לחלוטין את ספקטרום התגובה של מקרופאגים האדם העיקרי18. לכן, לצורך חקירת היווצרות מקרופאג ET בהגדרה הקלינית, מקרופאגים (HMDMs) של האדם הראשי הנגזר הנחשב להיות מודל רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מקרופאג כמו monocytic או murine.
שחרור ET מ-M1 מקוטב HMDMs הוכח לאחר החשיפה של תאים אלה למספר גירויים דלקתיים שונים, כולל myeloperoxidase הנגזר חומצה היפוכלורית חמצון (HOCl), PMA, TNFα, ו-IL-86. מתוארים כאן הוא פרוטוקול כדי להקטאת HMDMs ל-M1 פניטיפ ולדמיין שחרור MET לאחר מכן בחשיפה לגירויים דלקתיים אלה. PMA משמש גירוי של שחרור MET כדי להקל על השוואות למחקרים קודמים אשר השתמשו נויטרופילים. וחשוב מכך, HOCl, IL-8 ו-TNFα משמשים גם כדי לעורר שחרור MET, אשר האמינו להיות מודלים טובים יותר של הסביבה דלקתית ב vivo. השיטה המיקרוסקופית להדמיה של מהדורת ET כרוכה בצביעת ה-DNA של החילוץ בתרביות תאים חיים באמצעות שימוש ברעלים בירוק, הכתם הירוק של פלורסנט בלתי מורגש בצבע חומצות גרעין שהוחלו בהצלחה במחקרים הקודמים של נויטרופילים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ואיכותית של שחרור ET, אך אינה מתאימה כשיטה עצמאית לכמת של מידת שחרור ET. יש להשתמש במתודולוגיה חלופית אם הכמת נדרש כדי להשוות את היקף שחרור ET כתוצאה מתנאי טיפול שונים או התערבויות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדור וההדמיה של היווצרות MET באמצעות M1 הבדיל HMDMs מייצג חדש במודל מבחנה שעשוי להועיל לחקירת התפקיד הפתולוגי הפוטנציאלי של מבנים מקרופאג אלה, במיוחד תחת דלקתי כרונית תנאים. הוא מספק פרוטוקול חזק לגירוי של מקרופאגים אנושיים הראשי כדי לשחרר את המטס, אשר יכול גם להיות מנוצל במחקרים קשורים עם מונ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענק השפעה תמידי (IPAP201601422) ו נובו Nordisk קרן מענק פרויקט ביו-רפואי (NNF17OC0028990). YZ גם מודה בקבלת פרס לתואר שני אוסטרלי מאוניברסיטת סידני. אנחנו רוצים להודות למר פט פיסארו ולגב מורגן ג’ונס לסיוע בבידוד ובתרבות הרקמה המונבציט.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
