In vitro stimulering og visualisering av ekstracellulære Trap Release i differensiert Human monocytt-avledet makrofager
Summary
Presentert her er en protokoll for å oppdage macrophage ekstracellulære felle (MET) produksjon i levende cellekultur ved hjelp mikroskopi og fluorescens farging. Denne protokollen kan videre utvides til å undersøke bestemte MET protein markører ved immunofluorescence farging.
Abstract
Utgivelsen av ekstracellulære feller (ETs) av nøytrofile har blitt identifisert som en medvirkende faktor til utvikling av sykdommer knyttet til kronisk betennelse. De nøytrofile ETs (NETs) består av et maske av DNA, histone proteiner og ulike granule proteiner (dvs. myeloperoxidase, elastase og katepsin G). Andre immunceller, inkludert makrofager, kan også produsere ETs; men i hvilken utstrekning dette skjer i vivo og om macrophage ekstracellulære feller (METs) spiller en rolle i patologiske mekanismer har ikke blitt undersøkt i detalj. For bedre å forstå rollen som METs i inflammatoriske patologi, ble en protokoll utviklet for å visualisere MET utgivelse fra primære menneskelige makrofager in vitro, som også kan utnyttes i immunofluorescence eksperimenter. Dette gjør at ytterligere karakterisering av disse strukturene og deres sammenligning til ETs løslatt fra nøytrofile. Humant monocytt makrofager (HMDM) produserer METs ved eksponering for ulike inflammatoriske stimuli etter differensiering til M1 Pro-inflammatorisk fenotype. Utgivelsen av METs kan bli mikroskopi ved hjelp av en grønn fluorescerende nukleinsyre syre flekk som er impermeant til levende celler (f. eks SYTOX grønn). Bruk av nylig isolerte primære makrofager, slik som HMDM, er fordelaktig i modellering in vivo inflammatoriske hendelser som er relevante for potensielle kliniske anvendelser. Denne protokollen kan også brukes til å studere MET utgivelse fra menneskelige monocytt cellelinjer (f. eks, THP-1) følgende differensiering inn makrofager med phorbol isopropylmyristat acetate eller andre macrophage cellelinjer (f. eks den murine macrophage-lignende J774A. 1 celler).
Introduction
Utgivelsen av ETs fra nøytrofile ble først identifisert som en medfødt immunrespons utløst av bakteriell infeksjon1. De består av en DNA ryggrad som ulike granule proteiner med anti-bakterielle egenskaper er bundet, inkludert nøytrofile elastase og myeloperoxidase2. Den primære rollen til nøytrofile ETs (NETs) er å fange patogener og tilrettelegge deres eliminering3. Men i tillegg til den beskyttende rollen ETs i immunforsvaret, har et økende antall studier også oppdaget en rolle i sykdoms patogenesen, spesielt under utviklingen av betennelse-drevne sykdommer (dvs. revmatoid artritt og aterosklerose4). Utgivelsen av ETS kan utløses av ulike Pro-inflammatorisk cytokiner inkludert interleukin 8 (Il-8) og tumor nekrose faktor Alpha (TNFα)5,6, og den lokaliserte opphopning av ETs kan øke vevsskade og fremkalle en Pro-inflammatorisk respons7. For eksempel, ETs har vært innblandet som spiller en årsakssammenheng rolle i utviklingen av aterosklerose8, fremme trombose9, og forutsi kardiovaskulær risiko10.
Det er nå anerkjent at i tillegg til nøytrofile, andre immunceller (dvs. mastceller, eosinofile, og makrofager) kan også frigi ETs på eksponering for mikrobiell eller Pro-inflammatorisk stimulering11,12. Dette kan være spesielt viktig i tilfelle av makrofager, vurderer deres nøkkelrolle i utvikling, regulering, og oppløsning av kroniske inflammatoriske sykdommer. Derfor er det viktig å få en større forståelse av den potensielle forholdet mellom ET Release fra makrofager og betennelse-relaterte sykdomsutvikling. Nyere studier har vist tilstedeværelsen av METs og NETs i intakte menneskelige aterosklerotiske plaketter og organiserte trombi13. På samme måte har METs vært innblandet i å kjøre nyreskader gjennom regulering av inflammatoriske reaksjoner14. Men i motsetning til nøytrofile, er det begrensede data på mekanismer for MET formasjon fra makrofager. Nyere studier med human in vitro-modeller av MET-formasjonen viser noen forskjeller på banene som er involvert i hver celle type (dvs. om fraværet av histone citrullination med makrofager)6. Men, noen har vist at NET Release kan også forekomme i fravær av histone citrullination15.
Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en enkel og direkte metode for å vurdere MET utgivelse i en klinisk relevant macrophage modell. Det finnes en rekke forskjellige in vitro macrophage celle modeller som har blitt brukt til å studere METs (dvs. THP-1 menneskelige monocytt cellelinje og ulike murine macrophage cellelinjer)16. Det er noen begrensninger knyttet til disse modellene. For eksempel, differensiering av THP-1 monocytter til makrofager krever vanligvis en grunning trinn, for eksempel tilsetning av phorbol isopropylmyristat acetate (PMA), som selv aktiverer protein kinase C (PKC)-avhengige trasé. Denne prosessen er kjent for å utløse ET Release4 og resulterer i en lav basal oppfylt utgivelse fra THP-1 celler. Andre studier har fremhevet noen forskjeller i bioactivity og inflammatoriske responser montert av makrofager i vivo sammenlignet med PMA-behandlet THP-1 celler17.
Tilsvarende, atferd og inflammatoriske reaksjoner av forskjellige murine macrophage-lignende cellelinjer ikke helt representerer responsen spekteret av primære menneskelige makrofager18. Derfor, i den hensikt å undersøke macrophage ET formasjon i klinisk setting, primære menneskelige monocytt-avledet makrofager (HMDMs) antas å være en mer relevant modell i stedet for monocyttisk eller murine macrophage-lignende cellelinjer.
ET Release fra M1 polarisert HMDMs har blitt demonstrert etter eksponering av disse cellene til en rekke ulike inflammatoriske stimuli, inkludert myeloperoxidase-avledet oksiderende subsyrer syre (HOCl), PMA, TNFα, og IL-86. Beskrevet her er en protokoll for å polariserer HMDMs til M1 fenotype og visualisere påfølgende MET utgivelse ved eksponering for disse inflammatoriske stimuli. PMA brukes som en stimulans av MET utgivelse for å lette sammenligninger til tidligere studier som har brukt nøytrofile. Viktigere, HOCl, IL-8, og TNFα brukes også til å stimulere MET utgivelse, som antas å være bedre modeller av inflammatorisk miljø in vivo. Mikroskopisk metode for visualisering av ET Release innebærer farging av ekstracellulære DNA i levende cellekulturer bruker SYTOX grønn, en ugjennomtrengelig fluorescerende grønn nukleinsyre syre flekken som har blitt brukt i tidligere nøytrofile studier. Denne metoden gir rask og kvalitativ vurdering av ET utgivelse, men det er ikke hensiktsmessig som en frittstående metode for kvantifisering av ET Release grad. Alternative metoder bør brukes hvis kvantifisering er nødvendig for å sammenligne omfanget av ET utslipp som følge av ulike behandlings forhold eller intervensjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering og visualisering av MET-formasjonen ved hjelp av M1 differensiert HMDMs representerer en ny in vitro-modell som kan være nyttig for å undersøke den potensielle patologiske rollen til disse macrophage strukturene, spesielt under kronisk inflammatorisk Forhold. Det gir en robust protokoll for stimulering av primære menneskelige makrofager å løslate METs, som også kan benyttes i beslektede studier med menneskelige monocytt eller murine macrophage cellelinjer. Den vellykkede gjennomføringen av denne protok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en varig IMPACT Grant (IPAP201601422) og Novo nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ erkjenner også mottak av en australsk Postgraduate Award fra University of Sydney. Vi vil gjerne takke Mr. Pat Pisansarakit og MS Morgan Jones for å få hjelp med monocytt isolasjon og vev kultur.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
