Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes
Summary
Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d’immunofluorescence.
Abstract
La libération de pièges extracellulaires (ET) par les neutrophiles a été identifiée comme un facteur contribuant au développement de maladies liées à l’inflammation chronique. Les ETs de Neutrophiles (NET) se composent d’un maillage d’ADN, de protéines histones et de diverses protéines granules (c.-à-d. myeloperoxidase, élastase et cathepsine G). D’autres cellules immunitaires, y compris les macrophages, peuvent également produire des ET; cependant, dans quelle mesure cela se produit in vivo et si les pièges extracellulaires macrophages (MET) jouent un rôle dans les mécanismes pathologiques n’a pas été examiné en détail. Pour mieux comprendre le rôle des MET dans les pathologies inflammatoires, un protocole a été développé pour visualiser la libération de MET des macrophages humains primaires in vitro, qui peuvent également être exploités dans des expériences d’immunofluorescence. Cela permet une caractérisation plus poussée de ces structures et leur comparaison avec les ET libérées par les neutrophiles. Les macrophages humains dérivés du monocyte (HMDM) produisent des MET lors de l’exposition à différents stimuli inflammatoires après différenciation avec le phénotype pro-inflammatoire M1. La libération des MET peut être visualisée par microscopie à l’aide d’une tache d’acide nucléique fluorescent vert qui est imperméable aux cellules vivantes (p. ex., sYTOX vert). L’utilisation de macrophages primaires fraîchement isolés, tels que hmDM, est avantageuse dans la modélisation des événements inflammatoires in vivo qui sont pertinents pour les applications cliniques potentielles. Ce protocole peut également être employé pour étudier la libération de MET des lignées humaines de cellules de monocyte (par exemple, THP-1) suivant la différenciation en macrophages avec l’acétate de myristate de phorbol ou d’autres lignées de cellules de macrophage (par exemple, les cellules de Macrophage-like de macrophage murine-comme J774A.1).
Introduction
La libération d’ETs des neutrophiles a d’abord été identifiée comme une réponse immunitaire innée déclenchée par une infection bactérienne1. Ils se composent d’une colonne vertébrale de l’ADN à laquelle diverses protéines de granule avec des propriétés antibactériennes sont liés, y compris l’élastase neutrophile et myeloperoxidase2. Le rôle principal des ET neutrophiles (ENe) est de capturer les agents pathogènes et de faciliter leur élimination3. Cependant, en plus du rôle protecteur des ET dans la défense immunitaire, un nombre croissant d’études ont également découvert un rôle dans la pathogénie de la maladie, en particulier pendant le développement de maladies induites par l’inflammation (c.-à-d. la polyarthrite rhumatoïde et l’athérosclérose4). La libération des ET peut être déclenchée par diverses cytokines pro-inflammatoires, y compris l’interleukine 8 (IL-8) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF)5,6, et l’accumulation localisée d’ET peut augmenter les lésions tissulaires et évoquer un réponse pro-inflammatoire7. Par exemple, les ET ont été impliqués comme jouant un rôle causal dans le développement de l’athérosclérose8, la promotion de la thrombose9, et la prévision du risque cardiovasculaire10.
Il est maintenant reconnu qu’en plus des neutrophiles, d’autres cellules immunitaires (c.-à-d. les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages) peuvent également libérer des ET lors de l’exposition à la stimulation microbienne ou pro-inflammatoire11,12. Ceci peut être particulièrement significatif dans le cas des macrophages, considérant leur rôle clé dans le développement, la régulation, et la résolution des maladies inflammatoires chroniques. Par conséquent, il est important d’acquérir une meilleure compréhension de la relation potentielle entre la libération d’ET des macrophages et le développement de la maladie inflammation-connexe. Des études récentes ont montré la présence de METs et NETs dans les plaques atherosclérotiques humaines intactes et organisé thrombi13. De même, les MET ont été impliqués dans la conduite des lésions rénales par la régulation des réponses inflammatoires14. Cependant, contrairement aux neutrophiles, il existe peu de données sur les mécanismes de formation du MET à partir de macrophages. Des études récentes utilisant des modèles in vitro humains de formation MET montrent certaines différences dans les voies impliquées dans chaque type de cellule (c.-à-d., en ce qui concerne l’absence de citrullination histone avec des macrophages)6. Cependant, certains ont montré que la libération NET peut également se produire en l’absence de citrullination histone15.
L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode simple et directe pour évaluer la libération de MET dans un modèle de macrophage cliniquement pertinent. Il existe un certain nombre de différents modèles de cellules macrophages in vitro qui ont été utilisés pour étudier les ETM (c.-à-d., la lignée cellulaire monocyte humaine THP-1 et diverses lignées de cellules macrophages murine)16. Ces modèles sont liés à certaines limites. Par exemple, la différenciation des monocytes THP-1 aux macrophages nécessite généralement une étape d’amorçage, comme l’ajout d’acétate de myristate phorbol (PMA), qui active lui-même les voies dépendantes de la protéine kinase C (PKC). Ce processus est connu pour déclencher la libération ET4 et les résultats dans une libération basale faible MET des cellules THP-1. D’autres études ont mis en évidence certaines différences dans la bioactivité et les réponses inflammatoires montées par macrophages in vivo par rapport aux cellules THP-1 traitées par PMA17.
De même, le comportement et les réponses inflammatoires de différentes lignées cellulaires de type macrophage murine ne représentent pas complètement le spectre de réponse des macrophages humains primaires18. Par conséquent, dans le but d’étudier la formation d’ET de macrophage dans le cadre clinique, les macrophages humains primaires de monocyte-dérivé (HMDMs) sont censés être un modèle plus pertinent plutôt que monocytic ou murine macrophage-comme des lignes de cellules.
Et libération de M1 polarisé HMDMs a été démontré e après l’exposition de ces cellules à un certain nombre de stimuli inflammatoires différents, y compris l’acide hypochloreux oxydant dérivé de myeloperoxidase (HOCl), PMA, TNFMD, et IL-86. Décrit ici est un protocole pour polariser des HMDM au phénotype de M1 et visualiser la libération suivante de MET sur l’exposition à ces stimulus inflammatoires. La PMA est utilisée comme stimulus de la libération de MET pour faciliter les comparaisons avec les études précédentes qui ont utilisé des neutrophiles. Fait important, HOCl, IL-8, et TNF sont également utilisés pour stimuler la libération met, qui sont censés être de meilleurs modèles de l’environnement inflammatoire in vivo. La méthode microscopique pour la visualisation de la libération et consiste à tacher l’ADN extracellulaire dans les cultures cellulaires vivantes à l’aide de SYTOX vert, une tache d’acide nucléique vert fluorescent imperméable qui a été appliquée avec succès dans les études précédentes neutrophile. Cette méthode permet une évaluation rapide et qualitative de la libération et de l’ET, mais elle n’est pas appropriée comme méthode autonome pour la quantification de l’étendue de la libération ET. Une autre méthode devrait être utilisée si la quantification est nécessaire pour comparer l’étendue de la libération d’ET résultant de différentes conditions de traitement ou interventions.
Protocol
Representative Results
Discussion
La génération et la visualisation de la formation MET à l’aide de HMDM différenciés M1 représente un nouveau modèle in vitro qui peut être utile pour étudier le rôle pathologique potentiel de ces structures macrophages, en particulier sous inflammatoire chronique Conditions. Il fournit un protocole robuste pour la stimulation des macrophages humains primaires pour libérer des METs, qui peuvent également être utilisés dans des études connexes avec des lignées de cellules de macrophage de monocyte humain ou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention IMPACT perpétuelle (IPAP201601422) et Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ reconnaît également la réception d’un Australian Postgraduate Award de l’Université de Sydney. Nous tenons à remercier M. Pat Pisansarakit et Mme Morgan Jones pour leur aide dans l’isolement des monocytes et la culture tissulaire.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
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