각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발
Summary
여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.
Abstract
Nd:YAG 레이저는 지금 수십 년 동안 capsulotomy와 같은 비침범성 안구 수술을 수행하는 데 사용되었습니다. 절개 효과는 레이저 초점의 광학 고장에 의존합니다. 음향 충격파와 캐비테이션 버블이 발생하여 조직 파열을 일으킵니다. 기포 크기와 압력 진폭은 펄스 에너지와 초점 위치에 따라 달라집니다. 본 연구에서, 핵핵 돼지 눈은 시판되는 Nd:YAG 레이저 앞에 위치시켰다. 가변 펄스 에너지뿐만 아니라 각막에 대한 초점 반점 후방의 상이한 위치를 시험했다. 결과 병변은 최소한의 부수적 손상으로 각막 내피 세포 (CEC)의 독점적 인 분리를위한 최상의 매개 변수를 결정하기 위해 2 광자 현미경 검사법과 조직학에 의해 평가되었다. 이 방법의 장점은 CEC의 정밀한 절제, 감소된 부수적 손상, 그리고 무엇보다도 비접촉 식 치료입니다.
Introduction
각막의 투명성은 망막과 광수용체에 빛의 투과에 필수적이다1. 이와 관련하여, 탈수의 상대적인 상태는 각막 기질 내의 콜라겐 섬유를 정확하게 정렬시키는 데 중요합니다. 이 항상성은 Descemet의 막에 있는 각막 내피 세포 (CEC)에 의해 유지됩니다 (DM)2. 내피는 가장 안쪽 각막 층입니다. 그것은 각막 투명성에 중요한 장벽과 펌프 기능을 가지고3. 상피와는 달리, 내피는 자기 갱신 할 수 없습니다4. 따라서 질병 이나 외상으로 인한 임의의 세포 손상은 남은 내피 세포를 자극하여 확대 및 마이그레이션하고, 그로 인한 결함을 커버하고 각막 기능을 유지한다5. 그러나 CEC 밀도가 임계 값 이하로 떨어지면 내피의 부전이 발생하여 시력이 흐려지고 불편함이 생기거나 심한통증이 발생합니다 4. 증상을 완화하는 약물의 가용성에도 불구하고, 현재 이러한 경우 유일한 확실한 치료는 각막 이식이며, 이는 전체 두께 이식 또는 라멜라 내피 이식의 형태로 수행 될 수 있습니다. 후자의 절차는 Descemet의 막 내피 각막 각질 성형술 (DMEK)뿐만 아니라 Descemet의 스트리핑 자동화 된 내피 각막 성형술6(DSAEK)6으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 남아 있는 CEC의 보호 및 그들의 생존을 강화하는 것은 잠재적인 치료 약을 시험하기 위하여 적당한 질병 모형을 필요로 하는 대체 표적이 될 수 있었습니다.
현재 CEC 손실 질환 모델은 침습적 데시메터헥시스 기술을 사용하여 전위 챔버 내로 또는 세포의 기계적 마모에 의한 독성 제제(예를 들어, 벤잘코늄 염화물)의 주입을 통한 내피의 파괴에 초점을 맞추고있다.,8 이 모형은 잘 설치되는 동안, 일반적인 선동적인 반응 및 부정확한 부수적인 손상과 같은 단점이 존재합니다. 따라서, 이 모형은 전술한 외과 선택권이 불가피할 때 질병의 마지막 단계를 나타낼 확률이 높습니다.
줄기 세포 및 유전자 치료와 같은 세포 치료 전략의 발전과 함께, 이러한 세포 치료법의 적용은 CEC 손실9의초기 단계에서 유용 할 수 있습니다. 그 후, 우리는 질병의 이 초기 단계를 더 적당하게 나타내는 모형이 필요합니다. 이와 관련하여, 세포 배양 모델은 지난 10년 동안 개선되었지만, 시험관내 세포가 각막내의상이한 세포 유형 사이에서 발생하는 복잡한 상호작용을 복제하는 데 근접할 수 없기 때문에 그들의 타당성은 여전히 제한적이다. 따라서, 생체내 및 생체내 질환 모델은 여전히 수요가 많고 기존 것들을 개선하는 것이 가장 큰 관심사이다.
네오디뮴을 사용하여 사진 파괴에 의한 비침습적, 안구 내 수술:YAG (Nd:YAG) 레이저는 1970년대 후반11에도입된 이래 전 세계 안과 의사를 위한 일상적인 절차가 되었습니다. 광파괴는 적용 부위가 액체 환경에 위치할 때마다 플라즈마의 형성, 음향 충격파의 생성 및 캐비테이션 기포의 생성으로 이어지는 비선형 광 흡수에 의존한다12. 일반적으로, 이러한 과정은 정확한 조직 절단의 의도 된 효과에 기여한다. 그러나, 이들은 또한 레이저수술(13)의국소 감금을 제한하는 불필요한 부수적 손상의 원인이 될 수 있다.
충격파 전파 및 캐비테이션 과정의 특성화를 통해 기계적 효과의 예측이 크게 향상되었습니다. CEC 손실의 초기 단계에 대한 비침습적, 레이저 보조 실험 적 질병 모델을 제공하기 위해 가능한 한 주변 조직에 대한 손상이 적은 CEC를 대상으로하는 것이 우리의 목표입니다. 이를 위해, 최적의 펄스 에너지와 레이저의 초점 반점의 위치를 결정할 필요가있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 파일럿 연구의 결과는 Nd:YAG 레이저가 에너지 용량 및 초점 포인트 위치에 대한 적절한 매개 변수가 선택적으로 각막 내피 세포를 ablate하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다.
내피 기능은 각막 투명성과 기질 부종에서 각막을 보호하기 위해 중요하기 때문에, 내피 기능 장애의 모델은 항 부종 약물 이나 외과 적 절차의 개발에 중요한 역할을한다. 생체 내 상황1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
실험적인 방법에 도움을 주신 크리스틴 외룬과 얀 A. M. 소추렉에게 감사드립니다.
Materials
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
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