Utveckling av en noninvasive, Laser-Assisted experimentell modell av hornhinnans endotel cellförlust
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att lossa hornhinnans endotelceller (CEC) från Descemets membran (DM) med hjälp av en neodym:YAG (Nd:YAG) laser som en ex vivo sjukdom modell för bullous keratopathy (BK).
Abstract
Nd: YAG lasrar har använts för att utföra noninvasive intraokulär kirurgi, såsom capsulotomy i flera decennier nu. Den skarpt aktiverade effekten bygger på den optiska nedbrytningen vid laserfokus. Akustiska chockvågor och kavitationsbubblor genereras, vilket orsakar vävnadsbristning. Bubble storlekar och tryck amplituder varierar med puls energi och position i fokus. I denna studie, enucleated svin ögon placerades framför en kommersiellt tillgänglig Nd:YAG laser. Variabel puls energier samt olika positioner i fokalfläckarna posteriort till hornhinnan testades. Resulterande skador utvärderades av två foton mikroskopi och histologi för att bestämma de bästa parametrarna för en exklusiv avskildhet av hornhinnans endotel celler (CEC) med minsta indirekta skador. Fördelarna med denna metod är den exakta ablation av CEC, minskad oavsiktlig skada, och framför allt, den beröringsfria behandlingen.
Introduction
Insyn i hornhinnan är viktigt för överföring av ljus till näthinnan och dess fotoreceptorer1. I detta avseende är ett relativt tillstånd av uttorkning avgörande för att hålla kollagenfibrerna inom hornhinnans stroma korrekt anpassade. Denna homeostas underhålls av hornhinnans endotelceller (CEC) som ligger på Descemets membran (DM)2. Endotel är det innersta hornhinnans skikt. Den har en viktig barriär och pump funktion, vilket är avgörande för hornhinnans öppenhet3. I motsats till epitelet kan endotelet inteförnyas 4. Därför stimulerar alla cellskador orsakade av sjukdom eller trauma de återstående endotelcellerna att förstora och migrera, för att täcka resulterande defekter och för att bibehålla hornhinnans funktionalitet5. Men om CEC densitet faller under en kritisk tröskel, decompensation av endotel leder till ett ödem, vilket resulterar i dimsyn och obehag eller till och med svår smärta4. Trots tillgången på läkemedel för att lindra symtom, för närvarande den enda slutgiltiga behandlingen i dessa fall är hornhinnans transplantation, som kan utföras i form av en full-tjocklek moderplantor eller en lamellar endotel transplantation. Det senare förfarandet finns som Descemets membran endotel keratoplasty (DMEK) samt Descemets strippning automatiserad endotel keratoplasty (DSAEK)6. Skyddet av återstående cec och öka deras överlevnad kan dock vara ett alternativt mål, som behöver en adekvat sjukdomsmodell för att testa potentiella terapeutiska läkemedel.
Nuvarande CEC förlust sjukdom modeller fokuserar på förstörelsen av endotel genom injektion av giftiga ämnen (t.ex. bensalkoniumklorid) i den främre kammaren eller genom mekanisk nötning av cellerna med hjälp av en invasiv descemetorhexis teknik7,,8. Även om dessa modeller är väl etablerade, nackdelar såsom allmän inflammatorisk reaktion och oprecisa indirekta skador finns. Därför är dessa modeller mer benägna att representera slutskedet av sjukdomen, när de ovan nämnda kirurgiska alternativen är oundvikliga.
Med framsteg inom cellulära behandlingsstrategier såsom stamceller och genterapi, tillämpningen av dessa cellulära terapier kan vara användbart i ett tidigt skede av CEC förlust9. Därefter behöver vi en modell som representerar dessa tidigare stadier av sjukdomen på ett mer adekvat sätt. I detta avseende, cellodling modeller har förbättrats under det senaste decenniet, men är fortfarande begränsade i sin giltighet, som celler in vitro kan inte komma i närheten av att replikera de komplexa interaktioner som uppstår mellan de olika celltyperna inom hornhinnan10. Därför är ex vivo- och in vivo-sjukdomsmodeller fortfarande i hög efterfrågan och att förbättra de befintliga är av yttersta intresse.
Noninvasive, intraokulär kirurgi genom fotosubkultion med hjälp av en neodym: YAG (Nd: YAG) laser har blivit ett rutinförfarande för ögonläkare över hela världen sedan introduktionen i slutet av 1970-talet11. Fotodisruption bygger på ickelinjär ljusabsorption som leder till bildandet av plasma, generering av akustiska chockvågor och skapande av kavitationsbubblor, när applikationsstället är beläget i en flytande miljö12. I allmänhet bidrar dessa processer till den avsedda effekten av exakt vävnadsskärning. Men de kan också vara källan till onödiga indirekta skador som begränsar den lokala inneslutning av laserkirurgi13.
Förutsägelsen av resulterande mekaniska effekter har förbättrats avsevärt genom karakterisering av chockvågens förökning och kavitationskurs. Det är vårt mål att rikta CEC med så lite skada på omgivande vävnad som möjligt för att ge en noninvasive, laser-assisted experimentell sjukdom modell för de tidiga stadierna av CEC förlust. För detta ändamål är det nödvändigt att bestämma de optimala pulsenergierna och positionerna för laserns fokalfläckar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resultaten av denna pilotstudie visar att en Nd:YAG-laser kan användas för att selektivt ablate hornhinnans endotelceller när lämpliga parametrar för energidos och fokuspunktsposition väljs.
Eftersom endotelfunktionen är viktig för hornhinnans öppenhet och skydda hornhinnan från stromal ödem, modeller av endotel dysfunktion spelar en viktig roll i utvecklingen av anti-edematous läkemedel eller kirurgiska ingrepp. Det finns flera etablerade in vitro-modeller för att härma in vivo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Christine Örün och Jan A. M. Sochurek för deras hjälp med experimentella metoder.
Materials
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).
- Tuft, S. J., Coster, D. J. The corneal endothelium. Eye. 4, 389-424 (1990).
- Bourne, W. M. Biology of the corneal endothelium in health and disease. Eye. 17, 912-918 (2003).
- He, Z., et al. 3D map of the human corneal endothelial cell. Scientific Reports. 6, 29047 (2016).
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty. Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).
- Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy. Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).
- Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium. Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).
- Zhao, B., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).
- Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report. Journal – American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).
- Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers. Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).
- Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).
- Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro. International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).
- Li, Z., et al. Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing. Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).
- Pescina, S., et al. Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).
- Smeringaiova, I., et al. Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas. Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).
- Yamashita, K., et al. A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16868 (2018).
- Schubert, H. D., Trokel, S. Endothelial repair following Nd:YAG laser injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).
- Zhang, W., et al. Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser. Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).
- McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation. Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).
- Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. Corneal damage following focal laser intervention. Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).
