Нуклеофикция и В Виво Распространение куриных эймерийных паразитов
Summary
Здесь мы предоставили метод для достижения стабильной трансфекции куриных паразитов Эймерии нуклеэктингом спорозоитов или мерозоитов второго поколения. Генетически модифицированные эймерийские паразиты, выражающие гетерологические антигенные гены, могут быть использованы в качестве средств доставки вакцин.
Abstract
Трансфекция является техническим процессом, с помощью которого генетический материал, такой как ДНК и двухцепочечная РНК, поставляются в клетки для изменения гена, представляющего интерес. В настоящее время трансгенная технология становится незаменимым инструментом для изучения Эймерии,возбудительов кокцидиоза у птицы и скота. Этот протокол содержит подробное описание стабильной трансфекции у эймерских паразитов: очищение и нуклеофеирование спорозоитов или мерозоитов второго поколения, а также виво-распространение транс-инфицированных паразитов. Используя этот протокол, мы достигли трансфекции в нескольких видах Эймерии. В совокупности нуклеофикция является полезным инструментом для облегчения генетических манипуляций с эймерскими паразитами.
Introduction
Eimeria spp. вызывает кокцидиоз, что приводит к значительным экономическим потерям в животноводстве и птицеводстве. Хотя антикоккидные препараты, и в определенной степени, ослабленные антикокцидиальные вакцины, были широко использованы для контроля кокцидиоза, Есть еще недостатки в отношении их лекарственной устойчивости, остатков наркотиков, а также потенциальное распространение вакцин штаммов, которые восстанавливают вирулентность1. С развитием молекулярной биологии, трансфекция стала жизненно важным инструментом для изучения функций генов, разработки новых вакцин, а также скрининга новых целей наркотиков для Эймерии.
В последние десятилетия, трансфекция была успешно применена для апикомплексных паразитов, таких как Plasmodium и Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Исследование с использованием З-гал в качестве репортера для трансфекции в E. tenella пилотировал такую работу в Эймерии7. Трансфекция E. tenella8,9, E. mitis10, и E. acervulina (Чжан и др., неопубликованные данные) была успешной в кур. Недавно мы достигли трансфекции с использованием мерозоитов E. necatrix через нуклеофэкцию11.
Исследования показали, что Eimeria, выражающая гетерологический антиген, имеет потенциал для разработки в качестве рекомбинантной вакцины, например, тех, кто выражает Campylobacter jejuni antigen A (CjaA) или куриный интерлейкин 2 (chIL-2)12,13. Таким образом, этот протокол описывает нуклеофэкционное исследование Eimeria spp. у кур. Процедура описывает очищение спорозоитов или мерозоитов, нуклеофекцию с плазмидной ДНК, клоакальной прививки/внутривенную инъекцию и распространение виво, чтобы помочь исследователям начать исследования трансгенных паразитов Эймерии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В 1990-х годах была разработана трансфекционная система для паразитов-апикомплексных, и она использовалась для исследований эймерских паразитов. Недавно, стабильная трансфекция была проведена в E. tenella8,9 и E. nieschulzi15. Мы достигли стабил…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и разработок Китая (2017YFD0501200) и Национальным фондом естественных наук Китая (31572507, 31772728 и 31873007).
Materials
| ATP-disodium | Sigma | A26209 | |
| Cellulose DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| Constant Flow Pump | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| Glass beads | Sigma | Z250473-1PAK | |
| Glucose | Sigma | No. V900116 | |
| Glycine | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| Low Speed Centrifuge | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| Magnetic Mixer | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo cell sorter | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| Nucleofection device | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll (DG gradient stock solution) | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| Sodium taurodeoxycholate hydrate | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| The composition of DMEM: 4.5 g/L glucose with sodium pyruvate, L-glutamine, and 25 mM HEPES. | |||
| Trypsin | Solarbio | T8150 | |
| Vortex Mixer | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| Water Bath Thermostat | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
References
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker. Science. 262 (5135), 911-914 (1993).
- Sibley, L. D., Messina, M., Niesman, I. R. Stable DNA transformation in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii by complementation of tryptophan auxotrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5508-5512 (1994).
- Donald, R. G., Roos, D. S. Stable molecular transformation of Toxoplasma gondii: a selectable dihydrofolate reductase-thymidylate synthase marker based on drug-resistance mutations in malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (24), 11703-11707 (1993).
- Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
- Goonewardene, R., Daily, J., et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5234-5236 (1993).
- Kelleher, M., Tomley, F. M. Transient expression of beta-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella. Molecular and Biochemical Parasitology. 97 (1-2), 21-31 (1998).
- Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Molecular and Biochemical Parasitology. 162 (1), 77-86 (2008).
- Yan, W. C., et al. Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle. International Journal for Parasitology. 39 (1), 109-117 (2009).
- Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with Yellow Fluorescent Protein as Reporter and the Endogenous Development of the Transgenic Parasite. PloS One. 9 (12), e114188 (2014).
- Duan, C. H., et al. Stable transfection of Eimeria necatrix through nucleofection of second generation merozoites. Molecular and Biochemical Parasitology. , 1-5 (2019).
- Li, Z. R., et al. Transgenic Eimeria mitis expressing chicken interleukin 2 stimulated higher cellular immune response in chickens compared with the wild-type parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 533 (2015).
- Clark, J. D., et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA. Vaccine. 30 (16), 2683-2688 (2012).
- Eckert, J., Braun, R., Shirley, M. W., Coudert, P. Eimeria species and strains of chickens. Biotechnology: Guidelines on techniques in coccidiosis research. Part. I: Eimeria and Isospora, 1-24 (1995).
- Kurth, M., Entzeroth, R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi (Coccidia, Apicomplexa). Parasitology Research. 104 (2), 303-310 (2009).
- Tao, G. R., et al. Transgenic Eimeria magna Perard, 1925 Displays Similar Parasitological Properties to the Wild-type Strain and Induces an Exogenous Protein-Specific Immune Response in Rabbits (Oryctolagus cuniculus L.). Frontiers in Immunology. 8, 2 (2017).
- Shi, T. Y., et al. Stable Transfection of Eimeria intestinalis and Investigation of Its Life Cycle, Reproduction and Immunogenicity. Frontiers in Microbiology. 7, 807 (2016).
- Wang, P., et al. A novel telomerase-interacting OTU protein of Eimeria tenella and its telomerase-regulating activity. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (8), 744-745 (2017).
- Li, J. N., Zou, J., Yin, G. W., Liu, X. Y., Suo, X. Plasmid DNA could be delivered into Eimeria maxima unsporulated oocyst with gene gun system. Acta Polytechnica Hungarica. 60 (4), 431-440 (2012).
