मानव भ्रूण स्टेम सेल के एकल सेल संस्कृति का उपयोग कर कुशल तंत्रिका भेदभाव
Summary
यहां प्रस्तुत मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की एक एकल कोशिका संस्कृति की पीढ़ी और तंत्रिका जनक कोशिकाओं में उनके बाद भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल है । प्रोटोकॉल सरल, मजबूत, स्केलेबल, और दवा स्क्रीनिंग और पुनर्योजी दवा अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।
Abstract
मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (एचएसईसी) के विट्रो विट्रो विभेदन ने जैविक और आणविक दोनों स्तरों पर मानव विकास का अध्ययन करने की क्षमता को बदल दिया है और पुनर्योजी अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए कोशिकाएं प्रदान की हैं। विभिन्न रोगाणु परतों में भेदभाव के लिए अविभेदित एचएसईसी और भ्रूण शरीर (ईबी) और रोसेट गठन को बनाए रखने के लिए कॉलोनी प्रकार की संस्कृति का उपयोग करके एचएसईसी संस्कृति के लिए मानक दृष्टिकोण अक्षम और समय लेने वाले हैं। यहां प्रस्तुत एक एकल सेल संस्कृति विधि एक कॉलोनी प्रकार संस्कृति के बजाय hESCs का उपयोग कर रहा है । यह विधि अविभेदित एचएसईसी की विशेषता विशेषताओं के रखरखाव की अनुमति देती है, जिसमें कॉलोनी प्रकार के एचईएससी के तुलनीय स्तरों पर एचएसईसी मार्कर की अभिव्यक्ति शामिल है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल एकल सेल प्रकार एचएसईसी से तंत्रिका जनक कोशिका (एनपीसी) पीढ़ी के लिए एक कुशल तरीका प्रस्तुत करता है जो 1 सप्ताह के भीतर एनपीसी का उत्पादन करता है। ये कोशिकाएं कई एनपीसी मार्कर जीन को अत्यधिक व्यक्त करती हैं और डोपमिनर्जिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स सहित विभिन्न तंत्रिका कोशिका प्रकारों में अंतर कर सकती हैं। एचईसी के लिए यह एकल-सेल संस्कृति प्रणाली इन प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र, कुछ बीमारियों के अध्ययन और दवा खोज स्क्रीन की जांच करने में उपयोगी होगी।
Introduction
मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (hESCs) में तीन प्राथमिक रोगाणु परतों में अंतर करने की क्षमता होती है, जो तब विभिन्न बहुशक्तिशाली जनक कोशिका वंश में अंतर करती है। ये वंश बाद में मानव शरीर में सभी कोशिका प्रकारों को जन्म देते हैं। इन विट्रो एचएसआईसी संस्कृति प्रणालियों ने मानव भ्रूणीय विकास का अध्ययन करने की क्षमता को बदल दिया है और जैविक और आणविक स्तर पर इन प्रक्रियाओं को विनियमित करने के तरीके में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में कार्य किया है। इसी प्रकार, मानव रोगियों से अलग किए गए पुनर्प्रोग्रामिंग दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न प्रेरित प्लीरिटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) के अध्ययन विभिन्न रोगों में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इसके अलावा, एचसीईसी से प्राप्त जनक और विभेदित कोशिकाएं स्टेम सेल थेरेपी और दवा स्क्रीनिंग1,2,3,4से जुड़े अनुसंधान के लिए उपयोगी हो सकती हैं।
एचएसईसी को तंत्रिका जनक कोशिकाओं (एनपीसी) में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, जो एक व्यापक आत्म-नवीकरण क्षमता के साथ बहुसंभावित कोशिकाएं हैं। बाद में, इन कोशिकाओं को न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स5,6में अलग किया जा सकता है। एनपीसी न्यूरोडेवलपमेंटल बायोलॉजी और विभिन्न न्यूरोलॉजिकल बीमारियों के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक सेलुलर प्रणाली भी प्रदान करता है। हालांकि, वर्तमान कॉलोनी प्रकार की संस्कृति विधियां जिनमें एचसीसी और एनपीसी में उनके भेदभाव शामिल हैं, अक्षम हैं और अक्सर सहसंस्कृति के साथ-साथ भ्रूणीय शरीर (ईबी) और रोसेट गठन5,7,8,9शामिल होते हैं। ये प्रोटोकॉल कम जीवित रहने की दर और सहज भेदभाव प्रदर्शित करते हैं और अधिक समय लेने वाले होते हैं।
यहां प्रस्तुत एक बेहतर और मजबूत संस्कृति प्रणाली है जो आसानी से स्केलेबल है और एचईएससी10की उच्च घनत्व एकल-सेल प्रकार संस्कृति का उपयोग करती है। रोह-किनेज (रॉक) अवरोधक को शामिल करने से एचएसईएससी10,11,12,13, 14की एकल कोशिका प्रकार की संस्कृति के दौरान जीवित रहने की दक्षता में काफी वृद्धि हुई । इस संस्कृति प्रणाली में एचईएससी को आसानी से बनाए रखा और विस्तारित किया जा सकता है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल एचईसी की एकल-सेल प्रकार की संस्कृति से एनपीसी उत्पन्न करने के लिए एक कुशल तरीका प्रस्तुत करता है, जो अत्यधिक शुद्ध NPCs के उत्पादन की अनुमति देता है । एएलके अवरोधकों के साथ बीएमपी/टीजीएफ/एक्टिविन सिग्नलिंग पाथवे का अवरोध कुशलतापूर्वक एनपीसी15,16में एकल-सेल प्रकार के एचएसईसी के अंतर को प्रेरित करता है, जिसे तब डोपमिनर्जिक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स जैसे कार्यात्मक तंत्रिका वंशों में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है ।
संक्षेप में, एचईसी का उपयोग करके एकल-सेल प्रकार संस्कृति प्रोटोकॉल एनपीसी सहित विभिन्न वंशों में इन कोशिकाओं के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल आसानी से स्केलेबल है और इसलिए पुनर्योजी चिकित्सा और दवा स्क्रीनिंग से जुड़े अनुसंधान के लिए कोशिकाओं को पैदा करने के लिए उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विभिन्न वंशों में एचएसईसी के भेदभाव के लिए स्केलेबल और कुशल तरीके और विभेदित कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या का उत्पादन दवा स्क्रीनिंग और स्टेम सेल थेरेपी के लिए महत्वपूर्ण मानदंड हैं। विभिन्न एकल-कोशि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम FACS विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ कार्ल डी बोर्टनर (NIEHS) का शुक्रिया अदा करते हैं । इस शोध को राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, Z01-ES-101585 के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा AMJ को समर्थन दिया गया था ।
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
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