كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
Summary
المعروض هنا هو بروتوكول لتوليد ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والتمايز اللاحقة في خلايا السلف العصبية. البروتوكول بسيط وقوي وقابل للتطوير ومناسب للكشف عن المخدرات وتطبيقات الطب التجديدي.
Abstract
التفريق في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) قد حولت القدرة علي دراسة التنمية البشرية علي المستويين البيولوجي والجزيئي وتوفير الخلايا لاستخدامها في التطبيقات التجديدية. النهج القياسية للثقافة hESC باستخدام ثقافة نوع مستعمره للحفاظ علي Hesc غير متمايزة والجسم الجنيني (EB) وتشكيل الوردة للتمييز في طبقات جرثوميه مختلفه غير فعاله وتستغرق وقتا طويلا. المقدمة هنا هو أسلوب ثقافة خليه واحده باستخدام hESCs بدلا من ثقافة من نوع مستعمره. هذا الأسلوب يسمح الحفاظ علي السمات المميزة لل hESCs غير متمايزة ، بما في ذلك التعبير عن علامات Hescs علي مستويات مماثله لنوع مستعمره hESCs. الاضافه إلى ذلك ، يقدم البروتوكول طريقه فعاله للجيل الخلايا العصبية (المجلس الوطني لنواب الشعب) من نوع خليه واحده hESCs التي تنتج NPCs في غضون أسبوع 1. هذه الخلايا تعبر كثيرا عن الجينات علامة المجلس الوطني ويمكن التفريق في أنواع مختلفه من الخلايا العصبية ، بما في ذلك الخلايا العصبية الدوبامين و astrocytes. هذا النظام الثقافة خليه واحده لل hESCs سيكون مفيدا في التحقيق في أليات الجزيئية لهذه العمليات ، ودراسات لبعض الامراض ، وشاشات اكتشاف المخدرات.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لديها القدرة علي التفريق في الطبقات الجرثومية الاوليه الثلاث ، والتي تفرق بعد ذلك إلى مختلف السلالات خلايا السلف متعددة القوي. هذه السلالات تؤدي فيما بعد إلى جميع أنواع الخلايا في جسم الإنسان. وقد حولت نظم الثقافة في المختبر القدرة علي دراسة تطور الاجنه البشرية واستخدمت كاداه قيمه للحصول علي رؤى جديده حول كيفيه تنظيم هذه العمليات علي المستويين البيولوجي والجزيئي. المثل ، فان دراسات الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) المتولدة من أعاده برمجه الخلايا الجسدية المعزولة عن المرضي البشريين توفر رؤى جديده للامراض المختلفة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن للبروجنتور والخلايا المتمايزة المستمدة من hescs ان تكون مفيده للبحوث التي تنطوي علي العلاج بالخلايا الجذعية وفحص المخدرات1،2،3،4.
يمكن ان يكون مستحثا hESCs للتمييز في خلايا السلف العصبية (NPCs) ، والتي هي خلايا متعددة الإمكانات مع قدره واسعه التجديد الذاتي. فيما بعد, هذا خلايا يستطيع كنت ميزت داخل خليه عصبيه, [استروستس], و [اوليجوندروسايتس]5,6. كما تقدم NPCs نظاما خلويا للدراسات المختبرية لبيولوجيا النمو العصبي والامراض العصبية المختلفة. ومع ذلك ، فان أساليب الثقافة نوع مستعمره الحالية التي تنطوي علي hescs وتمايزها في npcs غير فعاله وغالبا ما تنطوي علي الزراعة وكذلك الجسم الجنيني (EB) وتشكيل الوردة5،7،8،9. وتظهر هذه البروتوكولات معدلات بقاء اقل وتمايزا عفويا وتستغرق وقتا أطول.
المعروض هنا هو نظام ثقافة محسنه وقويه التي هي قابله للتطوير بسهوله ويستخدم عاليه الكثافة خليه واحده ثقافة نوع من hESCs10. وساهم ادراج مثبطات روه-كيناز (روك) في تعزيز كفاءه البقاء علي قيد الحياة بشكل كبير اثناء ثقافة الخلية الواحدة من النوع hesc10و11و12و13و14. في هذا النظام الثقافي ، يمكن الحفاظ علي الhescs بسهوله وتوسيعها. الاضافه إلى ذلك ، يقدم البروتوكول طريقه فعاله لتوليد npcs من ثقافة نوع خليه واحده من hescs ، الذي يسمح لإنتاج npcs نقيه للغاية. تثبيط BMP/tgfβ/اكتيسين مسارات الإشارات مع مثبطات ألك بكفاءة للحث علي التمايز من نوع واحد من الخلايا hescs في npcs15،16، والتي يمكن ان يسببها بعد ذلك للتمييز في السلالات العصبية وظيفية ، مثل الخلايا العصبية الدوبامين و astrocytes
وباختصار ، فان بروتوكول ثقافة نوع خليه واحده باستخدام hESCs يقدم نموذجا جذابا لدراسة التفريق بين هذه الخلايا في مختلف السلالات ، بما في ذلك NPCs. هذا البروتوكول هو قابل للتطوير بسهوله ، التالي مناسبه لتوليد خلايا للبحوث التي تنطوي علي العلاج التجديدي وفحص المخدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن المعايير الهامه لفحص المخدرات والعلاج بالخلايا الجذعية الطرق القابلة للتطوير والكفاءة للتفريق بين الhescs والسلالات المختلفة وتوليد اعداد كافيه من الخلايا المتمايزة. وقد نشرت مختلف طرق تمرير خليه واحده, في الخلايا التي يتم استزراعها في وجود مثبطات الصخور أو غيرها من الجزيئات الصغيرة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور كارل د. بورتنر (NIEHS) علي مساعدته في تحليل النظام. وقد حظي هذا البحث بدعم برنامج البحوث داخل المعهد الوطني للعلوم الصحية البيئية ، والمعاهد الوطنية للصحة ، Z01-101585 إلى AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
