Effektiv neurale differentiering ved hjælp af enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller
Summary
Præsenteret her er en protokol til generering af en enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller og deres efterfølgende differentiering i neurale progenitorceller. Protokollen er enkel, robust, skalerbar og egnet til lægemiddel screening og regenerativ medicin applikationer.
Abstract
In vitro-differentiering af humane embryonale stamceller (hESCs) har ændret evnen til at studere menneskelig udvikling på både biologiske og molekylære niveauer og forudsat celler til brug i regenerativ applikationer. Standard tilgange til hESC kultur ved hjælp af koloni type kultur til at opretholde udifferentierede hESCs og embryo OID krop (EB) og Rosette dannelse for differentiering i forskellige kimlag er ineffektive og tidskrævende. Præsenteret her er en enkelt cellekultur metode ved hjælp af hESCs i stedet for en koloni-type kultur. Denne metode gør det muligt at vedligeholde de karakteristiske træk ved udifferentierede Hesc’er, herunder udtryk for hESC-markører på niveauer, der kan sammenlignes med koloni typen hESCs. Hertil kommer, at protokollen præsenterer en effektiv metode til neurale progenitorcelle (NPC) generation fra enkelt celletype hESCs, der producerer NPCs inden for 1 uge. Disse celler udtrykker meget flere NPC-markørgener og kan differentiere sig i forskellige neurale celletyper, herunder dopaminerge neuroner og astrocytter. Dette encellet kultur system til hESCs vil være nyttigt til at undersøge de molekylære mekanismer i disse processer, undersøgelser af visse sygdomme, og Drug Discovery skærme.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) har potentialet til at differentiere sig til de tre primære kimlag, som derefter differentieres i forskellige Multipotente progenitorcellelager. Disse nedstamningens efterfølgende give anledning til alle celletyper i den menneskelige krop. In vitro hESC kultur systemer har forvandlet evnen til at studere menneskelige embryonale udvikling og har tjent som et værdifuldt redskab til at opnå ny indsigt i, hvordan disse processer er reguleret på det biologiske og molekylære niveau. Tilsvarende undersøgelser af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) genereret fra omprogrammering somatiske celler isoleret fra humane patienter giver ny indsigt i forskellige sygdomme. Desuden kan progenitorceller og differentierede celler afledt af hESCs være nyttige for forskning, der involverer stamcelleterapi og Drug screening1,2,3,4.
hESCs kan induceres til at differentiere sig i neurale stamceller (NPC’er), som er multi potentielle celler med en omfattende selv fornyelseskapacitet. Efterfølgende kan disse celler differentieres i neuroner, astrocytter, og oligodendrocytter5,6. NPCs tilbyder også et cellulært system til in vitro-studier af neuroudviklingsmæssige biologi og forskellige neurologiske sygdomme. Men, nuværende koloni type kultur metoder, der involverer hESCs og deres differentiering i NPCs er ineffektive og involverer ofte coculture samt embryo OID krop (EB) og Rosette dannelse5,7,8,9. Disse protokoller udviser lavere overlevelsesrater og spontan differentiering og er mere tidskrævende.
Præsenteret her er et forbedret og robust kultur system, der er let skalerbar og bruger høj densitet enkelt celletype kultur af hESCs10. Inddragelsen af Roh-kinase (rock) inhibitor bidrog til signifikant forbedret overlevelse effektivitet under enkelt celletype kultur af hesc10,11,12,13,14. I dette kultur system kan hESCs nemt vedligeholdes og udvides. Hertil kommer, at protokollen præsenterer en effektiv metode til at generere NPCs fra enkelt-celletype kultur af hESCs, som tillader produktion af meget rene NPC’er. hæmning af BMP/tgfβ/Activity signalering veje med ALK-hæmmere effektivt fremkalde differentiering af enkelt celletype hESCs i NPCs15,16, som derefter kan blive induceret til at differentiere sig til funktionelle neurale lineages, såsom dopaminerge neuroner og astrocytter.
Kort sagt, den enkelt-celletype kultur protokol ved hjælp af hESCs tilbyder en attraktiv model til at studere differentieringen af disse celler i forskellige lineages, herunder NPCs. Denne protokol er let skalerbar og derfor egnet til at generere celler til forskning, der involverer regenerativ terapi og Drug screening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skalerbare og effektive metoder til differentiering af hESCs i forskellige nedstamningens og generering af et tilstrækkeligt antal differentierede celler er vigtige kriterier for lægemiddel screening og stamcelleterapi. Forskellige enkelt-celle forbipasserende metoder er blevet offentliggjort, hvor cellerne dyrkes i nærværelse af rock inhibitor eller andre små molekyler til at forbedre overlevelsen, men de endelige produkter af disse dyrkningsmetoder er koloni type hESCs17,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) for hans hjælp til FACS-analysen. Denne forskning blev støttet af det Intramural forsknings program af National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Z01-ES-101585 til AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
