Combinazione di microdissezione laser di cattura e qPCR microfluidico per analizzare i profili trascrizionali di singole cellule: un approccio di biologia dei sistemi alla dipendenza da oppioidi
Summary
Questo protocollo spiega come raccogliere singoli neuroni, microglia e astrociti dal nucleo centrale dell’amigdala con alta precisione e specificità anatomica utilizzando la microdissezione di cattura laser. Inoltre, spieghiamo il nostro uso di RT-qPCR microfluidico per misurare un sottoinsieme del trascrittoma di queste cellule.
Abstract
La profonda eterogeneità trascrizionale nelle singole cellule anatomicamente adiacenti suggerisce che la robusta funzionalità dei tessuti può essere ottenuta dalla diversità del fenotipo cellulare. Gli esperimenti a una cellula che studiano le dinamiche di rete dei sistemi biologici dimostrano risposte cellulari e tissutali a varie condizioni a risoluzione biologicamente significativa. Qui, spieghiamo i nostri metodi per raccogliere singole cellule da luoghi anatomicamente specifici e misurare accuratamente un sottoinsieme dei loro profili di espressione genica. Uniamo la microdisezione di cattura laser (LCM) con le reazioni della catena quantitativa di trascrizione inversa microfluidica (RT-qPCR). Usiamo anche questa piattaforma microfluidica RT-qPCR per misurare l’abbondanza microbica del contenuto intestinale.
Introduction
La misurazione dei profili di espressione genica di singole cellule ha dimostrato un’ampia eterogeneità fenotipica all’interno di un tessuto. Questa complessità ha complicato la nostra comprensione delle reti biologiche che governano la funzione dei tessuti. Il nostro gruppo e altri hanno esplorato questo fenomeno in molti tessuti e condizioni1,2,3,4,5,6. Questi esperimenti non solo suggeriscono che la regolazione delle reti di espressione genica è alla base di tale eterogeneità, ma anche che la risoluzione a singola cellula rivela una complessità nella funzione tissutale che la risoluzione a livello di tessuto non riesce ad apprezzare. Infatti, solo una piccola minoranza di cellule può rispondere a una condizione o a una sfida specifica, ma l’impatto di tali cellule sulla fisiologia generale può essere sostanziale. Inoltre, un approccio di biologia del sistema che applica metodi multivariati a set di dati ad alta dimensione da più tipi di cellule e tessuti può chiarire gli effetti di trattamento a livello di sistema.
Uniamo LCM e RT-qPCR microfluidico per ottenere tali set di dati. Adottiamo questo approccio qui in contrasto con la raccolta di singole cellule tramite lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) e l’utilizzo del sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) per misurare il loro trascrittoma. Il vantaggio di LCM rispetto a FACS è che l’esatta specificità anatomica delle singole celle può essere documentata con LCM, relativamente e assolutamente. Inoltre, mentre RNA-seq può misurare più caratteristiche che RT-qPCR, RT-qPCR microfluidico è meno costoso e ha una maggiore sensibilità e specificità7.
In questo esperimento rappresentativo, abbiamo studiato gli effetti della dipendenza da oppioidi e del ritiro degli oppioidi precipitati da naltrexone sul ratto neuronale, microglia, e l’espressione del gene astrocito nel nucleo centrale dell’amigdala (CeA) e della micro abbondanza intestinale4 . Sono stati analizzati quattro gruppi di trattamento: 1) Placebo, 2) Morphine, 3) Naltrexone e 4) Ritiro (Figura 1). Abbiamo scoperto che la dipendenza da oppioidi non alterava sostanzialmente l’espressione genica, ma che il ritiro da oppioidi indusse l’espressione di geni infiammatori, in particolare Tnf. Gli astrociti erano il tipo di cellula più colpita. Il microbioma intestinale è stato profondamente influenzato dal ritiro da oppioidi come indicato da una diminuzione del rapporto Firmicutes a Bacteroides, che è un marcatore stabilito della disbiosi intestinale8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
La biologia a cellula singola ha dimostrato l’eterogeneità dei fenotipi cellulari e la robustezza della funzione tissutale. Questi risultati hanno fornito informazioni sull’organizzazione dei sistemi biologici sia su macro che su microscala. In questo caso, descriviamo la combinazione di due metodi, LCM e qPCR microfluidico, per ottenere misure di trascrittoma a cella singola che forniscono specificità anatomica e precisione trascrizionale a un costo relativamente basso (Figura 1). Il nost…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro qui presentato è stato finanziato tramite NIH HLB UL1 33360 assegnato a JS e RV, NIDA R21 DA036372 assegnato a JS ed EVB, e T32 AA-007463 assegnato a Jan Hoek a sostegno di SJO’S.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
