Das Ziel dieser Studie ist es, das orthotopische Lebertransplantationsmodell der Ratte zu modifizieren, um die Transplantation menschlicher Leber besser darzustellen und das Überleben der Empfänger zu verbessern. Die vorgestellte Methode stellt den hepatischen arteriellen Zufluss wieder her, indem die gemeinsame Leberarterie der Spenderleber mit der richtigen Leberarterie der Empfängerleber verbunden wird.
Das Modell der orthotopischen Lebertransplantation (OLT) der Ratte ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um akute und chronische Abstoßung zu untersuchen. Es ist jedoch keine vollständige Darstellung der menschlichen Lebertransplantation aufgrund des Fehlens einer arteriellen Wiederverbindung. Hier wird ein modifiziertes Transplantationsverfahren beschrieben, das die Wiederverbindung der Leberarterie (HA) umfasst, was zu einer deutlichen Verbesserung der Transplantationsergebnisse führt. Mit einer durchschnittlichen anhepatischen Zeit von 12 min und 14 s führt die HA-Wiederverbindung zu einer verbesserten Perfusion der transplantierten Leber und einer Erhöhung des langfristigen Überlebens der Empfänger von 37,5 % auf 88,2 %. Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von 3D-gedruckten Manschetten und Haltern, um die Portalvene und die infrahepatische minderwertige Vena cava zu verbinden. Es kann für die Untersuchung mehrerer Aspekte der Lebertransplantation implementiert werden, von der Immunantwort und Infektion bis hin zu technischen Aspekten des Verfahrens. Durch die Integration einer einfachen und praktischen Methode zur arteriellen Wiederverbindung mit einer mikrovaskulären Technik imitiert dieses modifizierte Ratten-OLT-Protokoll Aspekte der menschlichen Lebertransplantation und dient als wertvolles und klinisch relevantes Forschungsmodell.
Die weltweite Belastung durch Lebererkrankungen nimmt weiter zu, mit einem Anstieg der Todesfälle durch Lebererkrankungen um 30 % von 2005 bis 20131,2. Lebertransplantationistin ist oft der einzige Regress für Patienten mit Lebererkrankungen im Endstadium. Die Leber ist das am zweithäufigsten transplantierte feste Organ, und die Zahl der Lebertransplantationen weltweit durchgeführt stieg um 7,25% von 2015 bis 20161,2. Trotz seiner Prävalenz stagnieren die Überlebensraten nach der Transplantation3,4,5. Die Überlebensrate des 15-jährigen Patienten liegt den Angaben zufolge bei 53 %, und die Überlebensrate des 20-jährigen Patienten kann bei 21%3,5liegen. Zwar gibt es aufregende neue immunbiologische Initiativen, die zu neuen Behandlungen und verbesserten klinischen Ergebnissen führen können, aber es gibt noch kein zuverlässiges Modell für Kleintiere, um sie zu testen.
Die Ratte OLT-Modell wurde weit verbreitet in der Untersuchung von Lebertransplantation, einschließlich Ablehnung6,7,8,9,10, Immuntoleranz11, Transplantation Ischämie-Reperfusionsverletzung12, Immunsuppression13, und Gallenbaum Verletzung14,15,16,17. Ein Nachteil des Modells in seiner jetzigen Form ist jedoch seine hohe postoperative Morbidität und Mortalität18,19. Dies ist ein gravierender Nachteil, der im Widerspruch zur menschlichen Operation steht, und es beeinträchtigt die Fähigkeit, klinisch relevante Schlussfolgerungen aus dem Modell20zu ziehen.
Darüber hinaus kann ein großer Teil dieser Morbidität auf eine fehlende oder unvollkommene Leberarterie (HA) zurückgeführt werden18. Obwohl ein kritischer Schritt bei der Transplantation menschlicher Leber, neigen technische Schwierigkeiten dazu, die HA-Wiederverbindung im OLT-Modell der Ratte zu beeinträchtigen. Infolgedessen ist Gallengang (BD) Anastomose schwach und führt zu hohen Raten von Gallenlecks und BD-Nekrose21. Jenseits der hohen Inzidenz von Gallenkomplikationen22verändert das Fehlen eines arteriellen Zuflusses die Physiologie der Transplantatleber nach der Transplantation23, mit Hypoxie im Spenderlebertransplantat24 und Leberschäden, die in entzündeten Lappen beobachtet wurden19,25,26. Ratte OLT ohne arterielle Wiederverbindung neigt auch dazu, Fibrose zu fördern27. Das unten beschriebene Ratten-OLT-Protokoll befasst sich mit diesen Problemen, indem es einen einfachen HA-Rekonstruktionsschritt mit einer zuvor veröffentlichten Ratten-OLT-Methode28einbezieht, was zur Erhaltung von Leberparenchym und verbesserten Überlebensraten führt.
Die Lebertransplantation hat drei Phasen: (1) Extraktion des Lebertransplantats vom Spender, (2) Vorbereitung des Spenderlebertransplantats und (3) Ersatz der Empfängerleber durch das Lebertransplantat. Das Verfahren beinhaltet die Manipulation von fünf anatomischen Strukturen: die suprahepatische untere Vena cava (SHVC), Portalvene (PV), infrahepatische minderwertige Vena cava (IHVC), Leberarterie (HA) und Gallengang (BD).
OLT in der Ratte wurde zuerst von Lee et al. mit Mikrosuture Anastomose der SHVC, PV und IHVC eingeführt, und eine Durchziehtechnik für die BD29. Dieses Modell wurde später durch den Einsatz der Zwei-Manschette-Technik im Jahr 197930verbessert. Seitdem wurden mehrere alternative Techniken vorgeschlagen, wobei sich die Mehrheit auf venöse Anastomose konzentrierte und eine Zwei-Manschetten-Technik mit einigen Modifikationenverwendete 31. Obwohl HA Anastomose zuvor im OLT-Modell der Ratte mit Techniken wie Mikronaht, Manschette und intraluminale Hülsen26,31,32,33,34beschrieben wurde, erfordern diese Techniken oft hochqualifizierte mikrochirurgische Fähigkeiten, verändern die Physiologie der Ratte signifikant und werden durch Thrombose und/oder Gallenkomplikationen behindert27,35.
Darüber hinaus kann die Wahl des chirurgischen Eingriffs auch die anhepatische Zeit beeinflussen (Zeit von PV-Klemmung bis zur Reperfusion von Transplantat durch die rekonstituierte PV), was für den Erfolg der Rattenlebertransplantation entscheidend ist. Insbesondere werden hohe Überlebensraten mit anhepatischen Zeiten von 15-20 min36beobachtet, und 30 min ist die obere Erfolgsgrenze37,38. Daher ist das Ziel dieser Methode, ein weniger invasives und leichter zu adoptierbares chirurgisches Ratten-OLT-Modell zu implementieren, das in der Lage ist, die Leberarterie wieder zu verbinden, eine effiziente Durchblutung der transplantierten Leber zu fördern, den Fluss zum Gallengang des Empfängers aufrechtzuerhalten und den physiologischen Zustand des Empfängers zu erhalten.
Hier sind alle Schritte dieses überarbeiteten Protokolls aufgeführt, einschließlich der Manipulation des Zöliakie-Stamms der Spenderleber sowie der Verwendung von 1) einem 1,5 mm Stent zur Durchführung einer extraluminalen Hülsenverbindung mit dem Empfänger, der tatsächlich HA, 2) einer laufenden Naht für die SHVC-Rekonstruktion, 3) zwei 3D-gedruckten Kunststoffmanschetten für PV- und IHVC-Rekonstruktion39,40, 4) eine mikrovaskuläre Hülsenverbindung für die HA18,27,41 und 5) eine zuvor beschriebene BD-Stenting-Technik28. Zwei weitere Schritte sind ebenfalls enthalten: eine Kaltspülung über die PV und ein Antibiotika-Regime, das auf früheren Befunden basiert17. Dieses optimierte OLT-Protokoll minimiert perioperative Komplikationen und Morbidität und modelliert den chirurgischen Operationsprozess bei der Transplantation menschlicher Leber genauer.
Kleintierlebertransplantationsmodelle sind wichtig, um die Transplantatimmunität zu verstehen und neuartige therapeutische Strategien zu identifizieren32. Das ideale Modell der Kleintierlebertransplantation repliziert alle Schritte des menschlichen Verfahrens, einschließlich der arteriellen Anastomose. Es kann schwierig sein, Ergebnisse aus dem OLT-Modell der Ratte zu interpretieren, da die meisten Versionen keinen HA-Anastomose-Schritt enthalten, was zu höheren Komplikations- und Morbiditätsraten führt42. Einige Rekonstruktionsverfahren haben die Nierenarterie verwendet, die Entfernung der Niereerfordert 27. Dieses Protokoll vermeidet die Organentfernung, da es über das hinausgeht, was im menschlichen Verfahren vorkommt.
Arterielle Rekonstruktionen können auch durch Manipulation der Rattenaorta31durchgeführt werden. Diese Methoden erfordern jedoch eine umfangreiche Zerlegung und Klemmung der Aorta. Wenn die Klemmzeit verlängert wird, dann wird die Empfängerratte schlechte Ergebnisse im Zusammenhang mit distaler Ischämie43haben. Beim Menschen beinhaltet eine LT-Chirurgietechnik die Ligation und Teilung der Empfänger-Gastroduodenalarterie (GDA). Die physiologischen und anatomischen Merkmale von Nagetieren machen die Transplantation mit dieser Technik jedoch physiologisch anspruchsvoller und können zu Komplikationen führen (d. h. Nekrose der Bauchspeicheldrüse und des Gallengangs35 und Gallenleckage44). Die arterielle Wiederverbindung in diesem Protokoll soll diese Herausforderung umgehen, den Kanaldurchfluss aufrechterhalten und das Empfängerergebnis verbessern.
Die Verwendung einer Hülsen- und Stenting-Technik zur Rekonstruktion der Ratte HA wurde bereits beschrieben27. Bei dieser Technik wird ein Stent als Leitfaden verwendet, und die Arterie wird vom Spenderzöllstamm zum Empfänger common HA rekonstruiert. Der gemeinsame HA des Empfängers wird dann seziert, und der Empfänger-GDA wird27abgebunden. Als Ergebnis kann die Blutversorgung des unteren Teils des Empfängers BD und Kopf der Bauchspeicheldrüse beeinträchtigt werden. Es wird angenommen, dass die Kollateralzirkulation in diesen Bereich oft unzureichende Durchblutung des Gallengangs bietet. Dieses Protokoll-Test klemmt z. B. den Empfänger-GDA zunächst mit einem mikrovaskulären Clip und teilt dann den Empfänger-BD. Mit dem GDA geklemmt, blutet der geteilte BD nicht. Nach dem Entfernen der GDA-Klemme wird eine kräftige Blutung aus dem BD beobachtet. Dieses Protokoll, das einen guten Fluss zum geteilten Empfänger Gallengang aufrechterhält, schützt die Physiologie des Lebergewebes des Empfängers, indem es eine ausreichende Leberblutdurchblutung bereitstellt und eine hypoxische Leberverletzung nach dem OLT verhindert.
Auf der Spenderseite wird der HA-Stent während der Transplantatvorbereitung mit Leichtigkeit in den Zöliakiestamm eingeführt, indem ein Pflaster aus dem Zöliakiestamm, der linken Magenarterie und der Milzarterie erstellt wird. Der Stent kann durch die breite Öffnung eingeführt werden, was weniger schwierig ist, als zu versuchen, den Stent allein in den Zöliakiestamm einzufügen. Es wurde festgestellt, dass 24 G eine ideale Größe für den HA-Stent ist. Die Länge des Stents sollte 1,0-1,5 mm lang sein, da er als offenes Tor dient, damit der richtige HA des Empfängers leicht in die gemeinsame HA des Spenders gezogen werden kann. Mit sorgfältiger Aufmerksamkeit, wo die 10-0 Ethilon Naht platziert wird, wird Blut, das durch diese Verbindung fließt, nie den Stent direkt berühren, und die richtige HA des Empfängers wird ihn von innen abschirmen, wodurch das Risiko von Komplikationen reduziert wird. Wichtig ist, dass die HA des Spenders nie eingeklemmt wird, um Vasospasmus zu vermeiden. Der Erfolg der arteriellen Rekonstruktion wird bewertet, indem der Spender GDA offen gelassen wird. Eine erfolgreiche Anastomose führt nach Abschluss des Wiederaufbaus zu einem guten Blutfluss des Spender-GDA.
In diesem Protokoll ist die SHVC-Wiederverbindung, ähnlich wie bei anderen, der langsamste Schritt und bestimmt letztlich die Dauer der anhepatischen Phase. Mit zunehmender Dauer der anhepatischen Zeit erhöht sich das Risiko ischämischer Verletzungen und Leberfunktionsstörungenum 45. Eine weitere wichtige Komponente der OLT-Rattenmodelle sind die Größe des Transplantats, der Stents und der Manschetten. Wenn das Transplantat zu klein ist, kann sich das Transplantat drehen oder kippen, was die Gefäßverbindungen behindert. Die Größe der Stents und Manschetten kann Anpassungen in Anmaßung des Alters, des Geschlechts, des Gewichts und der Belastung der Ratte erfordern. Die Größe der hier verwendeten Manschetten wurde wie zuvor beschrieben28gewählt, und es wurde eine Manschettengröße verwendet, die für die Rattengröße kontrolliert wurde. Während der Nachbeobachtungszeit (bis heute: Median = 133 Tage nach der Operation, mindestens = 115 Tage nach der Operation, maximal = 161 Tage nach der Operation) gab es keine Anzeichen von Not oder Komplikationen (d. h. Leberstaus, Ödeme, Aszites oder Splenomegalie). Weitere Studien zur Bestimmung der geeigneten Größe von PV und IHVC für verschiedene Rattenstämme, die sowohl Alter als auch Geschlecht berücksichtigen, sind gerechtfertigt.
Dieses modifizierte Ratten-OLT-Protokoll verwendet 3D-gedruckte Manschetten für PV und IHVC, wie zuvor beschrieben39,40. Bestehende Methoden zum Anschluss der PV und IHVC umfassen eine Mikronahttechnik32, Manschettentechnik46und Mikronaht-temporäre Schiene Technik47. Die 3D-gedruckte Manschettentechnik wurde gewählt, da sie es ermöglicht, die Größe der Manschette nach Rattenstamm zu standardisieren und ist einfach zu zuzubereiten und zu verwenden. Große Mengen von Manschetten mit den gleichen Abmessungen können auf einmal gedruckt werden. Die Außenfläche der Manschette hat zwei Rillen, um die Sicherung der Krawatten zu unterstützen und ein Verrutschen zu verhindern. Ein Schwanz ist auch in das Manschettendesign integriert, um eine einfachere Manipulation der Manschette zu ermöglichen. Insgesamt wird angenommen, dass die Integration von 3D-gedruckten Manschetten zu hohen Erfolgsraten und Reproduzierbarkeit des OLT-Verfahrens führt, indem die Anhepatenzeit verkürzt wird. Es wird festgestellt, dass diese Technik auch die chirurgische Lernkurve verkürzt.
Zusammenfassend wurde mit dem beschriebenen Protokoll ein Modell festgelegt, das der Transplantation menschlicher Leber ähnlicher ist, indem ein arterieller Wiederverbindungsschritt integriert wird. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um viele immunologische und chirurgische Aspekte der Lebertransplantation zu untersuchen und kann als Modell dienen, um neuartige therapeutische Interventionen zu testen, die für die Transplantation relevant sind.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde aus Mitteln des Multi-Organ-Transplantationsprogramms an der UHN und der Unterstützung der Toronto General und Toronto Western Foundation finanziert.
10-0 Ethilon | Ethicon | 2830G | 10-0 Ethilon Black 1X5" BV100-4 Taper |
10mL Syringe | BD | B302995 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
1mL Syringe | BD | B309628 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
20mL Syringe | BD | B301031 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
3D Printed Cuff for IHVC | Custom | ||
3D Printed Cuff for PV | Custom | ||
3D Printed Holder for IHVC | Custom | ||
3D Printed Holder for PV | Custom | ||
3mL Syringe | BD | B309657 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
4-0 Sofsilk | Coviden | GS-835 | Wx coded braided silk, 30", Suture 1-Needle 26 mm Length 1/2 Circle Taper Point Needle |
5-0 Monocryl | Ethicon | Y433H | Undyed Monofilament 1X27" TF |
5mL Syringe | BD | B309646 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
7-0 Silk | Teleflex Medical | 103-S | Black |
8-0 Prolene | Ethicon | 2775G | 8-0 Prolene Blue 1X24" BV130-5 EVP Double Armed |
Barraquer Micro Needle Holder Without Catch | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | Curved 120 mm, 4 3/4″ |
Barraquer Needle Holder, Extra Fine Jaws 8.0mm, Curved With Out Lock | Rumex International Co. | 8-025T | Small Size, Titanium |
Barraquer Needle Holder, Fine Jaws 12.0mm, Curved With Out Lock | Rumex International Co. | 8-021T | Small Size, Titanium |
BD Insyte Autoguard BC 22 GA x 1.00 IN | BD Angiocath / Autoguard | 382523 | 22 G x 1.00" (0.9 mm x 25 mm) Wingless catheter, 37 mL/min |
BDPrecisionGlide Single-use Needles: Regular Bevel – Regular Wall. | BD | B305106 | PrecisionGlide stainless-steel needles with translucent, color-coded, polypropylene hubs. 22 G |
BD Precisionglide Syringe Needle 21G | BD | 305167 | Gauge 21, length 1.5 inch, hypodermic needle |
BD Precisionglide Syringe Needle 30G | BD | 305128 | Gauge 30, length 1 inch, hypodermic needle |
Betadine Solution by Purdue Products LP | Purdue Products Lp | 67618-150-17 | 10% povidone–iodine topical solution USP |
Bupivacaine Injection BP 0.5% | SteriMax Inc. | DIN:02443694 | 0.5% (100mg/20mL) |
Curved Tying Forceps | Duckworth & Kent | 2-501E | 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 88mm |
DC Temperature Controller | FHC Inc. | 40-90-8D | |
DK Iris Scissors (Curved) | Duckworth & Kent | 1-211B | Blunt tips, cut length 4mm, tip to pivot length 11mm, round handle, length 107mm |
Ethanol, 200 proof (100%), USP, Decon Labs | Decon Labs, Inc. | 2716 | Dilute to 70% with d2H2O |
Fine Adjustable Wire Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | Maximum spread: 3.5cm, Depth 5cm |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Appartus Limited | 34-1040SV | |
Heparin LEO(heparin sodium) | LEO Pharma Inc. | DIN:00453811 | 10,000 i.u./10 mL |
Ice-Pak | Cryopak | FIP88016 | 4.00 in. x 7.00 in., thickness 1.50 inch |
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP) 99.9% | Piramal Healthcare Limited | DIN: 02231929 | 250 mL, Inhalation Anesthetic, NDC 66794-017-25 |
Khaw Transconjunctival Adjustable Suture Control Forceps | Duckworth & Kent | 2-502N | 5mm highly polished tying platforms, straight shafts, flat handle, length 84mm |
Lactate Ringer's Injected USP, 1000mL | Baxter Co. | DIN: 00061085 | JB2324 |
McPherson Tying Forceps | Duckworth & Kent | 2-500E | 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 90mm |
Metzenbaum Scissors – 14.5 cm | Fine Science Tools | 14024-14 | Straight Sharp/Blunt |
Micro Kitzmiller Clamp | Scanlan | 3003-630 | Jaw length 23mm, Length 11cm |
Microscope-Leica M525 F20 | Leica Microsystems | No catalog number | |
Non-woven Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-028-556 | |
Olsen-Hegar with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | 15 mm cutting edge, 2mm jaw surface – 14cm |
OptixCare Eye Lube, 25gm | OptixCare | ES-KE8O-69U1 | Formerly Optixcare Surgical Eye Lubricant |
Piperacillin sodium salt | Sigma-Aldrich | P8396 | Penicillin analog |
Puritan 3" Standard Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company LLC | 803-WC | Regular Cotton Tipped Applicator with Wooden Handle |
Round Handled Needle Holder Straight w/ Lock | Fine Science Tools | 12075-12 | Round handles allow easy fingertip adjustments – 12.5cm |
Shea Scissors Curved Blunt | Fine Science Tools | 14105-12 | Transplant scissors with light and delicate pattern – 12cm |
Stainless Steel Micro Serrefines Curved – 4mm | Fine Science Tools | 18055-06 | Jaw length 4mm, Jaw width 0.75mm, Total length 16mm, Jaw pressure 125g |
Stainless Steel Micro Serrefines Curved – 6mm | Fine Science Tools | 18055-05 | Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 17mm, Jaw pressure 100g |
Stainless Steel Micro Serrefines Straight – 6mm | Fine Science Tools | 18055-03 | Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 15mm, Jaw pressure 100g |
Surgical Platform | Custom, magnetic | ||
SurgiVet Vaporstick Anesthesia Machine | General Anesthetic Services, Inc | V7015 | |
T/Pump Localized Therapy | Stryker | TP700 Series | |
Vacuum-Pressure Pump | Barnant Co. | 400-1901 | |
Vannas Scissors with Microserrations Straight | Fine Science Tools | 15070-08 | Cutting edge: 5mm, Tip diameter: 0.1mm – 8.5cm |
Vetergesic Buprenorphine | Ceva Animal Health Ltd | NAC No.:12380352 | 0.324 mg/ml buprenorphine hydochloride Solution for Injection for Dogs and Cats |
Vetroson V-10 Bipolar Electrosurgical Unit | Summit Hill Laboratories | No catalog number |