मॉडल फेफड़ों स्क्वैमस कार्सिनोमा प्रगति के लिए बहुआयामी सहसंस्कृति प्रणाली
Summary
कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) के साथ 3-आयामी (3डी) सह-संस्कृति में फेफड़ों के स्क्वैमस कार्सिनोमा (एलएलएससी) प्रगति के दौरान ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों को पकड़ने के लिए एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली विकसित की गई थी। यह ऑर्गेनॉइड सिस्टम ट्यूमर फेनोटाइप को मिलाने वाले विविध ट्यूमर सेल-आंतरिक और बाह्य परिवर्तनों की भूमिकाओं की जांच करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है।
Abstract
ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन फेफड़ों के स्क्वैमस कार्सिनोमा (एलएएससी) के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, यह समझना कि ट्यूमरके दौरान देखे गए ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों में ये गतिशील बातचीत कैसे योगदान देती है, उपयुक्त मॉडलों की कमी के कारण चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक 3 डी सहसंस्कृति मॉडल की पीढ़ी का वर्णन करते हुए एक LUSC प्राथमिक सेल संस्कृति का उपयोग करके जिसे TUM622 के नाम से जाना जाता है। TUM622 कोशिकाओं को एलयूएससी रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) से स्थापित किया गया था और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में वरीयता प्राप्त होने पर एसीनार जैसी संरचनाओं को बनाने के लिए अद्वितीय संपत्ति है। हम प्रदर्शित करते हैं कि 3 डी कोकल्चर में TUM622 acini LUSC प्रगति के दौरान ऊतक वास्तुकला की प्रमुख विशेषताओं के साथ-साथ ल्यूएससी कोशिकाओं और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME) के घटकों के बीच गतिशील बातचीत को संक्षिप्त करता है, जिसमें एक्स्सेल्युलर भी शामिल है मैट्रिक्स (ईसीएम) और कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) । हम अपने प्रमुख 3डी क्यूल्चरिंग प्रोटोकॉल को और अनुकूलित करते हैं ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि विभिन्न डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए इस प्रणाली का उपयोग कैसे किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह ऑर्गेनॉइड मॉडल एक जैविक रूप से समृद्ध और अनुकूलनीय मंच बनाता है जो कोशिका-आंतरिक और बाह्य तंत्रों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में सक्षम बनाता है जो कैंसर विज्ञान प्रगति के दौरान एपिथेलियल आर्किटेक्चर के व्यवधान को बढ़ावा देता है और सहायता करेगा नए चिकित्सीय लक्ष्यों और नैदानिक मार्कर के लिए खोज।
Introduction
फेफड़ों का कैंसर दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मृत्यु का प्रमुख कारण है । फेफड़ों स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (LUSC), जो गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) का दूसरा सबसे आम प्रकार है और सभी फेफड़ों के कैंसर के लगभग 30% के लिए खातों, अक्सर उंनत चरणों में निदान किया जाता है और एक गरीब पूर्वानुमान1है । LUSC रोगियों के लिए उपचार के विकल्प एक प्रमुख अपूरित जरूरत है कि अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र है कि LUSC ट्यूमर रोगन ड्राइव की एक बेहतर समझ से सुधार किया जा सकता है ।
अधिकांश मानव कैंसर के साथ, एलओएससी के रोगजनन को बरकरार, अच्छी तरह से आदेश ित एपिथेलियल ऊतक वास्तुकला2के व्यवधान की विशेषता है। इस प्रक्रिया के दौरान, उचित एपिकल-बेसल सेल ध्रुवता, सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स संपर्क खो जाते हैं, जिससे ट्यूमर कोशिकाओं के अनियंत्रित विकास और आक्रामक व्यवहार की अनुमति मिलती है। अब यह व्यापक रूप से सराहना की है कि कैंसर की कोशिकाओं की घातक सुविधाओं कैंसर की कोशिकाओं और उनके स्थानीय ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME)3के बीच एक महत्वपूर्ण परस्पर क्रिया के बिना प्रकट नहीं किया जा सकता है । एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम), कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) के साथ-साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं और घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित TME में प्रमुख घटक सक्रिय रूप से TME को आकार देते हैं और ट्यूमरजेनेसिस4चलाते हैं। फिर भी, कैसे ट्यूमर कोशिकाओं और TME में इन प्रमुख घटकों के बारे में हमारी वर्तमान समझ LUSC प्रगति के दौरान ऊतक वास्तु परिवर्तन ड्राइव करने के लिए बातचीत बहुत सीमित है ।
त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों दोनों में ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तनों को विनियमित करने में कोशिका-आंतरिक और बाह्य परिवर्तनों की जैविक गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरणहै। 3डी संस्कृतियां उपयुक्त संरचनात्मक और कार्यात्मक संदर्भ प्रदान करती हैं जो आमतौर पर पारंपरिक दो-आयामी (2डी) संस्कृतियों में कमी होती है। इस तरह के सिस्टम के अतिरिक्त आयाम अधिक बारीकी से सेल फिजियोलॉजी और सेलुलर व्यवहार के कई पहलुओं में वीवो में ऊतक की नकल, प्रसार, भेदभाव, प्रवास, प्रोटीन अभिव्यक्ति और दवा उपचार के लिए प्रतिक्रिया सहित । हाल के वर्षों में, विभिन्न प्रयोगशालाओं के प्रयासों से सामान्य फेफड़ों के साथ-साथ एनएससीएलसी6,7,8दोनों के लिए इन विट्रो 3डी मॉडल का विकास हुआ है । हालांकि, फेफड़ों के स्क्वैमस कार्सिनोमा के लिए एक मॉडल जो ट्यूमरके जेनेसिस के दौरान गतिशील ऊतक वास्तुशिल्प परिवर्तन ों दोनों को फिर से तैयार कर सकता है और साथ ही प्रमुख स्ट्रोमल घटकों को शामिल कर सकता है, अनुपलब्ध था।
यहां, हम प्राथमिक पीडीएक्स-व्युत्पन्न एलएएससी कोशिकाओं (TUM622 कहा जाता है) और CAFs9,,10का उपयोग करके एक उपन्यास 3-आयामी (3 डी) सहसंस्कृति प्रणाली स्थापित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। TUM622 और CAFs दोनों एनएससीएलसी रोगी से प्राप्त होते हैं, जिनमें खराब विभेदित ट्यूमर10होते हैं । जब ईसीएम में एकल कोशिकाओं के रूप में एम्बेडेड होता है, तो TUM622 कोशिकाओं की एक दुर्लभ उप-जनसंख्या में एसिनार जैसी संरचनाओं के साथ ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता होती है जो उचित एपिकल-बेसल सेल ध्रुवता प्रदर्शित करते हैं। ये एसीनार जैसी संरचनाएं हाइपरप्लास्टिक हैं, जो गैर-आक्रामक रहते हुए मूल ट्यूमर के समान स्टेम-जैसे और विभेदन मार्कर की विषम अभिव्यक्ति प्रदर्शित करती हैं, और इस प्रकार एलयूएससी विकास के शुरुआती चरण की नकल करती हैं। महत्वपूर्ण बात, हमने दिखाया कि एसीनार जैसी संरचनाओं के ऊतक वास्तुकला को छोटे अणु अवरोधकों या ईसीएम जैसे सीएएफ में प्रमुख घटकों के अलावा सेल-आंतरिक सिग्नलिंग रास्तों के अवरोध से बदला जा सकता है, जिनमें से उत्तरार्द्ध एसीनी गठन को बढ़ाता है और निकटता में होने पर एसिनी को आक्रामक बनने के लिए उकसाता है। एक साथ, इन आंकड़ों से पता चलता है कि LUSC ऑर्गेनॉइड की यह 3डी सह-संस्कृति प्रणाली LUSC कोशिकाओं और TME के बीच गतिशील पारस्परिकता की जांच के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करती है और11दवा उपचार के लिए LUSC कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमर कैंसर कोशिकाओं से बने विषम ऊतक हैं जो कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं और ईसीएम के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ-साथ मौजूद होते हैं। साथ में, ये विव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मैगली गफरॉय, जॉन क्रेगर और फाइजर-ऑन्कोलॉजी हिस्टोपैथोलॉजी और बायोमार्कर समूह के स्टेफनी बिसुल्को को पैथोलॉजी/हिस्टोलॉजी सपोर्ट के लिए और माइकल एरेन्समैन को पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए धन्यवाद देते हैं । हम इस कार्यक्रम के समर्थन के लिए फाइजर पोस्टडॉक्टोरल प्रोग्राम और ऑन्कोलॉजी आर एंड डी समूह, विशेष रूप से रॉबर्ट अब्राहम, पूजा सपरा, करेन विडबिन और जेनिफर तेजादा को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
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