Многомерная система кокультуры для моделирования плоского квадроцикла Прогрессирование карциномы
Summary
Система модели in vitro была разработана для захвата архитектурных изменений тканей при плоской карциноматической карциномате легких (LUSC) прогрессии в трехмерной (3D) совместной культуре с связанными с раком фибробластами (CAFs). Эта органоидная система обеспечивает уникальную платформу для изучения роли различных опухолевых клеток, интродуцированных и насущных изменений, которые модулируют фенотип опухоли.
Abstract
Опухолево-стромноговые взаимодействия играют решающую роль в развитии плоской карциномы легких (LUSC). Однако понимание того, как эти динамические взаимодействия способствуют изменениям в области архитектуры, наблюдаемым во время опухолевого генеза, остается сложным из-за отсутствия соответствующих моделей. В этом протоколе мы описываем генерацию 3D-модели кокультуры с использованием культуры первичных клеток LUSC, известной как TUM622. Tum622 клетки были созданы из LUSC пациента полученных ксенотрансплантат (PDX) и имеют уникальное свойство формировать ацинар-подобных структур, когда семенами в подвале мембраны матрицы. Мы демонстрируем, что TUM622 acini в 3D-кокультуре переизглашает ключевые особенности архитектуры тканей во время прогрессии LUSC, а также динамические взаимодействия между клетками LUSC и компонентами микроокружения опухоли (TME), включая внеклеточные матрицы (ECM) и связанные с раком фибробласты (CAFs). Мы также адаптируем наш основной 3D культивирование, чтобы продемонстрировать, как эта система может быть использована для различных анализов ниже по течению. В целом, эта органоидная модель создает биологически богатую и адаптируемую платформу, которая позволяет получить представление о клеточных и внутренних механизмов, которые способствуют нарушению эпителиальной архитектуры во время прогрессирования карциномы и помогут поиск новых терапевтических целей и диагностических маркеров.
Introduction
Рак легких является основной причиной смертности, связанной с раком во всем мире. Карцинома легких плоскоклеточной (LUSC), которая является вторым наиболее распространенным типом немелкоклеточного рака легких (NSCLC) и составляет примерно 30% всех раковых заболеваний легких, часто диагностируется на поздних стадиях и имеет плохой прогноз1. Варианты лечения для пациентов LUSC являются одной из основных неудовлетворенных потребностей, которые могут быть улучшены путем лучшего понимания основных клеточных и молекулярных механизмов, которые управляют LUSC опухолевого.
Как и в большинстве случаев рака человека, патогенез LUSC характеризуется нарушением нетронутыми, хорошо упорядоченной эпителиальной ткани архитектуры2. В ходе этого процесса утрачены надлежащие атикально-базальные клеточные полярности, клеточные клетки и клеточные матричные контакты, что позволяет неконтролируемый рост и инвазивное поведение опухолевых клеток. В настоящее время широко ценится, что злокачественные особенности раковых клеток не могут проявляться без важного взаимодействия между раковыми клетками и их местной микросредой опухоли (TME)3. Ключевые компоненты в TME, включая внеклеточной матрицы (ECM), связанные с раком фибробласты (ЦАФ), а также эндотелиальные клетки и инфильтрации иммунных клеток активно формируют TME и диски tumorigenesis4. Тем не менее, наше текущее понимание того, как опухолевые клетки и эти ключевые компоненты в TME взаимодействуют, чтобы управлять тканевыми архитектурными изменениями во время прогрессии LUSC, очень ограничено.
Трехмерная (3D) культура является важным инструментом для изучения биологической активности клеточных и насущных изменений в регулировании архитектурных изменений тканей как в нормальных, так и в болезненных тканях5. 3D культуры обеспечивают соответствующий структурный и функциональный контекст, который обычно отсутствует в традиционных двухмерных (2D) культур. Дополнительные размеры таких систем более точно имитируют ткани in vivo во многих аспектах физиологии клеток и клеточного поведения, включая пролиферацию, дифференциацию, миграцию, экспрессию белка и реакцию на медикаментозное лечение. В последние годы усилия различных лабораторий привели к разработке в пробирке 3D-моделей как для обычныхлегких,так и для NSCLC6,7,,8. Тем не менее, модель плоской карциномы легких, которая может резюмировать как динамические архитектурные изменения ткани во время опухолевого, а также включить ключевые стромальные компоненты был недоступен.
Здесь мы описываем методы создания новой 3-мерной (3D) системы сокультуры с использованием первичных PDX-производных клеток LUSC (термин TUM622) и CAFs9,10. Оба TUM622 и CAFs являются производными от NSCLC пациента с плохо дифференцированных опухолей10. При встраиваемых в себя в качестве одиночных клеток в ECM, редкая субпопуляция клеток TUM622 имеет возможность формировать органоиды с ацинар-подобными структурами, которые отображают надлежащее атикально-базальной полярности клеток. Эти ацинар-подобные структуры гиперпластичны, демонстрируют неоднородное выражение стволовых и дифференциационных маркеров, похожих на исходную опухоль, оставаясь при этом неинвазивными, и таким образом имитируют самую раннюю стадию развития LUSC. Важно отметить, что мы показали, что архитектура тканей ацинаровоподобных структур может быть изменена путем ингибирования клеточных сигнальных путей с помощью мелких молекулных ингибиторов или добавления ключевых компонентов в ECM, таких как ЦАФы, последний из которых усиливает образование ацини и еще больше провоцирует ацини стать инвазивными, когда в непосредственной близости. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что эта 3D-система сокультуры органоидов LUSC является ценной платформой для исследования динамической взаимности между клетками LUSC и TME и может быть адаптирована для мониторинга реакции клеток LUSC на медикаментозное лечение11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опухоли являются неоднородными тканями, состоящими из раковых клеток, сосуществующих бок о бок со стромальными клетками, такими как связанные с раком фибробласты, эндотелиальные клетки и иммунные клетки в ECM. Вместе эти разнообразные компоненты перекрестного разговора и влияния на ми?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Магали Гаффрой, Джона Кригера и Стефани Бисулко из группы Гистопатология И Пфайфер и Биомаркера за поддержку патологии/гистологии, а Майкла Аренсмана за критический обзор рукописи. Мы также благодарим Pfizer Постдокторской программы и онкологии НИОКР группы, в частности, Роберт Абрахам, Пуджа Сапра, Карен Widbin и Дженнифер Tejeda за их поддержку программы.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
