多维共同培养系统模拟肺鳞癌进展
Summary
开发了一个体外模型系统，用于捕捉与癌症相关成纤维细胞 （CAF） 共同培养的三维 （3D） 共同培养中肺鳞状癌 （LUSC） 进展期间的组织结构变化。该器官系统提供了一个独特的平台来研究各种肿瘤细胞内在和外在变化的作用，调节肿瘤表型。
Abstract
肿瘤-斯特罗马相互作用在肺鳞癌（LUSC）的发展中起着关键作用。然而，由于缺乏适当的模型，了解这些动态相互作用如何促进肿瘤发生期间观察到的组织结构变化仍然具有挑战性。在此协议中，我们描述了使用 LUSC 主细胞培养（称为 TUM622）生成 3D 共培养模型。TUM622细胞由LUSC患者衍生的异种移植物（PDX）建立，具有独特的特性，在地下室膜基质中播种时形成类似甲烷的结构。我们演示了在3D共同培养中TUM622 acini在LUSC进展期间重述组织结构的关键特征，以及LUSC细胞与肿瘤微环境（TME）组件之间的动态相互作用，包括细胞外基质 （ECM） 和癌症相关成纤维细胞 （CAFs）。我们进一步调整我们的主要3D培养协议，以演示如何将该系统用于各种下游分析。总体而言，这个器官模型创造了一个生物学丰富和适应性强的平台，使人们能够深入了解细胞内在和外在机制，促进上皮结构在癌变过程中破坏，并将有助于寻找新的治疗靶点和诊断标记。
Introduction
肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因。肺鳞状细胞癌（LUSC），是非小细胞肺癌（NSCLC）的第二常见类型，约占所有肺癌的30%，通常诊断为晚期，预后差1。LUSC 患者的治疗选择是一个主要未满足的需求，可以通过更好地了解推动 LUSC 肿瘤生成的基础细胞和分子机制来改进。
与大多数人类癌症一样，LUSC的发病机制的特点是破坏完整、有序的上皮组织架构2。在这个过程中，适当的肛门-基底细胞极性、细胞细胞和细胞基质接触丢失，从而允许肿瘤细胞不受控制的生长和侵入性行为。现在人们普遍认识到，癌细胞的恶性特征不能表现出，没有癌细胞与局部肿瘤微环境（TME）3之间的重要相互作用。3TME中的关键成分包括细胞外基质（ECM）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）以及内皮细胞和渗透免疫细胞，积极塑造TME并驱动肿瘤发生4。然而，我们目前对TME中肿瘤细胞和这些关键成分在LUSC进展过程中如何相互作用以驱动组织架构变化的理解非常有限。
三维（3D）培养是研究细胞内在和外在调节正常组织和病变组织中组织结构变化的生物活动的重要工具。3D 区域性提供了传统二维 （2D） 区域性中通常缺少的合适结构和功能上下文。这些系统的附加维度更密切地模仿体内组织在细胞生理学和细胞行为的许多方面，包括增殖、分化、迁移、蛋白质表达和对药物治疗的反应。近年来，各实验室的努力已导致正常肺和NSCLC66、7、87,8的体外3D模型的发展。然而，一个肺鳞状癌的模型，可以重述肿瘤发生期间的动态组织结构变化，以及纳入关键的基质成分是不可用的。
在这里，我们描述了使用主要PDX衍生的LUSC细胞（称为TUM622）和CAF9、10,10建立新型三维（3D）共培养系统的方法。TUM622和CAF均来自肿瘤不良的NSCLC患者10。当作为单个细胞嵌入ECM时，TUM622细胞的罕见亚群能够形成具有类似甲形结构的器官，以显示适当的锥形基底细胞极性。这些类似同形的构造是超塑性的，在保持非侵入性的同时，表现出类似茎的异质表达和分化标记物，同时保持非侵入性，从而模仿LUSC发展的最早阶段。重要的是，我们表明，通过抑制带有小分子抑制剂的细胞内通信号通路或加入ECM中的关键组分（如CAF）来改变类似阿基纳尔结构的组织结构，后者可增强阿基尼的形成，并进一步促使阿基尼在近距离侵入。这些数据共同表明，LUSC器官的这种3D共同培养系统为研究LUSC细胞与TME之间的动态互惠提供了一个有价值的平台，并可用于监测LUSC细胞对药物治疗的反应。
Protocol
Representative Results
Discussion
肿瘤是由癌细胞与巨发细胞并存的异质组织，如癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和ECM内的免疫细胞。这些不同的成分相互交扰并影响肿瘤微环境，在推动肿瘤形成方面起着积极的作用，这个过程涉及肿瘤结构的渐进变化。理想情况下，肿瘤发育的体外模型应该能够捕捉人体肿瘤体内观察到的动态组织结构变化，在肿瘤微环境中各种细胞类型的复杂相互作用，同时允许对TME中的肿瘤细胞和成分进行?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢马加里·古夫罗伊、约翰·克雷格和辉瑞肿瘤学组织病理学和生物标志物小组为病理学/组织学支持而对手稿进行批判性审查的斯蒂芬尼·比苏尔科。我们还感谢辉瑞博士后计划和肿瘤研发小组，特别是罗伯特·亚伯拉罕、普贾·萨普拉、卡伦·维布丁和詹妮弗·特杰达对该计划的支持。
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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