Akciğer Skuamöz Karsinom Progresyonunu Modellemek Için Çok Boyutlu Coculture Sistemi
Summary
İn vitro model sistemi, akciğer skuamöz karsinomu (LUSC) ilerlemesi sırasında kanserle ilişkili fibroblastlarla (CAF) 3 boyutlu (3D) bir ortak kültürde doku mimari değişikliklerini yakalamak için geliştirilmiştir. Bu organoid sistem tümör fenotip modüle çeşitli tümör hücre içsel ve dışsal değişikliklerin rollerini araştırmak için benzersiz bir platform sağlar.
Abstract
Tümör-stroma etkileşimleri akciğer skuamöz karsinom (LUSC) gelişiminde kritik bir rol oynamaktadır. Ancak, bu dinamik etkileşimlerin tümörigenez sırasında gözlenen doku mimari değişikliklerine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak, uygun modellerin olmaması nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu protokolde, TUM622 olarak bilinen Bir LUSC birincil hücre kültürünü kullanarak bir 3B coculture modelinin oluşumunu tanımlıyoruz. TUM622 hücreleri Bir LUSC hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) kuruldu ve bir bazal membran matris tohumlu zaman acinar benzeri yapılar oluşturmak için benzersiz özelliği var. 3D kokültürdeki TUM622 acini’nin LUSC ilerlemesi sırasında doku mimarisinin temel özelliklerinin yanı sıra LUSC hücreleri ile tümör mikroortamının (TME) bileşenleri arasındaki dinamik etkileşimleri, hücre dışı matris (ECM) ve kanserle ilişkili fibroblastlar (CAFs). Bu sistemin çeşitli downstream analizleri için nasıl kullanılabileceğini göstermek için temel 3D kültür protokolümüzü daha da uyarlıyoruz. Genel olarak, bu organoid model karsinom ilerlemesi sırasında epitel mimarilerinin bozulmasını teşvik hücre içsel ve dışsal mekanizmalar içine fikir kazanmak için olanak sağlayan bir biyolojik zengin ve uyarlanabilir platform oluşturur ve yardımcı olacaktır yeni terapötik hedefler ve tanı belirteçleri için arama.
Introduction
Akciğer kanseri dünya çapında kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedenidir. Akciğer skuamöz hücreli karsinom (LUSC), hangi olmayan küçük hücreli akciğer kanseri ikinci en yaygın türüdür (NSCLC) ve tüm akciğer kanserinin yaklaşık% 30 hesapları, genellikle ileri evrelerde teşhis edilir ve kötü prognoz vardır1. LUSC hastaları için tedavi seçenekleri, LUSC tümörigenezini yönlendiren altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması ile geliştirilebilen önemli bir karşılanmamış ihtiyaçlardır.
Çoğu insan kanserlerinde olduğu gibi, LUSC patogenezi bozulmamış bozulması ile karakterizedir, iyi sıralanmış epitel doku mimarisi2. Bu süreçte, uygun apikal-bazal hücre polaritesi, hücre-hücre ve hücre-matriks kontaklar kaybolur, kontrolsüz büyüme ve tümör hücrelerinin invaziv davranış sağlar. Kanser hücrelerinin malign özelliklerinin kanser hücreleri ile yerel tümör mikroçevreleri (TME) arasında önemli bir3etkileşim olmadan ortaya çıkarılamadığı artık yaygın olarak takdir edilmektedir 3. Ekstrasellüler matriks (ECM), kanserle ilişkili fibroblastlar (CAFs) yanı sıra endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri sızma dahil TME önemli bileşenleri aktif TME şekil ve tümörigenesis sürücüler4. Bununla birlikte, Tümör hücrelerinin ve TME’deki bu temel bileşenlerin LUSC ilerlemesi sırasında doku mimari değişikliklerini yönlendirmek için nasıl etkileşime girdiğine dair mevcut anlayışımız çok sınırlıdır.
Üç boyutlu (3D) kültür, hem normal hem de hastalıklı dokularda doku mimari değişikliklerini düzenleyen hücre içsel ve dışsal değişikliklerin biyolojik faaliyetlerini incelemek için önemli bir araçtır5. 3B kültürler genellikle geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlerde eksik olan uygun yapısal ve işlevsel bağlamı sağlar. Bu tür sistemlerin eklenen boyutları, hücre fizyolojisi ve hücresel davranışların birçok alanında, çoğalma, farklılaşma, göç, protein ekspresyonu ve ilaç tedavisine yanıt dahil olmak üzere in vivo dokuyu daha yakından taklit eder. Son yıllarda, çeşitli laboratuvarlardan gelen çabalar hem normal akciğer hem de NSCLC6,7,,8için in vitro 3D modellerin geliştirilmesine yol açmıştır. Ancak, tümörigenez sırasında hem dinamik doku mimari değişiklikleri hem de önemli stromal bileşenleri dahil özetleyebilir akciğer skuamöz karsinom için bir model kullanılamaz.
Burada, birincil PDX türetilmiş LUSC hücreleri (TUM622 olarak da adlandırılır) ve CAFs9,10kullanarak yeni bir 3 boyutlu (3D) coculture sistemi kurma yöntemlerini açıklıyoruz. Hem TUM622 hem de CAFs, az diferansiye tümörlü NSCLC hastasından türetilmiştir10. ECM’de tek hücre olarak gömülü olduğunda, TUM622 hücrelerinin nadir bir alt popülasyonu uygun apikal bazal hücre polaritesini gösteren acinar benzeri yapılara sahip organoidler oluşturma kapasitesine sahiptir. Bu acinar benzeri yapılar hiperplastiktir, kök benzeri heterojen bir ifade gösterir ve orijinal tümöre benzer farklılaşma belirteçleri gösterirken non-invaziv olarak kalır lar ve böylece LUSC gelişiminin en erken evresini taklit eder. Daha da önemlisi, açinar benzeri yapıların doku mimarisinin hücre içi sinyal yollarının küçük molekül inhibitörleri ile inhibisyonu veya AF gibi ECM’deki anahtar bileşenlerin eklenmesiyle değiştirilebileceğini gösterdik, ikincisi acini oluşumunu geliştirir ve acini’yi yakın mesafede yken invaziv hale getirmek için daha da kışkırtır. Birlikte, bu veriler LUSC organoidlerin bu 3D co-kültür sistemi LUSC hücreleri ve TME arasındaki dinamik karşılıklılık soruşturma için değerli bir platform sağlar ve ilaç tedavisi11LUSC hücrelerinin yanıtını izlemek için adapte edilebilir öneririz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümörler, kanserle ilişkili fibroblastlar, endotel hücreleri ve ECM içindeki bağışıklık hücreleri gibi stromal hücrelerle yan yana bulunan kanser hücrelerinden oluşan heterojen dokulardır. Birlikte, bu çeşitli bileşenleri çapraz konuşmak ve tümör mikroçevre etkisi, tümörigenez sürüş aktif bir rol oynarken, tümör mimarisinde ilerleyici değişiklikler içeren bir süreç. İdeal olarak, tümör gelişiminin in vitro modeli, in vivo insan tümörlerinde gözlenen dinamik doku mimari değişikl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pfizer-Onkoloji Histopatolojisi ve Biyomarker grubundan Magali Guffroy, John Kreeger ve Stephani Bisulco’ya patoloji/histoloji desteği için ve Michael Arensman’a makalenin eleştirel incelemesi için teşekkür ederiz. Ayrıca Pfizer Doktora Sonrası Programı ve Onkoloji Ar-Ge grubuna, özellikle Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin ve Jennifer Tejeda’ya programa verdikleri destekten dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
