Flerdimensjonal kokultur system for å modellere lungeplatekarsinom progresjon
Summary
Et in vitro-modellsystem ble utviklet for å fange vevarkitektoniske endringer under lungeplatekarsinom (LUSC) progresjon i en 3-dimensjonal (3D) co-kultur med kreft-assosierte fibroblaster (CAFs). Dette organoidsystemet gir en unik plattform for å undersøke rollene til ulike tumorcelle-iboende og ekstriniske endringer som modulerer tumorfenotypen.
Abstract
Tumor-stroma interaksjoner spiller en avgjørende rolle i utviklingen av lunge plateepitelkarsinom (LUSC). Men å forstå hvordan disse dynamiske interaksjonene bidrar til vevarkitektoniske endringer observert under tumorigenesis er fortsatt utfordrende på grunn av mangel på passende modeller. I denne protokollen beskriver vi genereringen av en 3D-kokulturmodell ved hjelp av en LUSC primærcellekultur kjent som TUM622. TUM622 celler ble etablert fra en LUSC pasientavledet xenograft (PDX) og har den unike egenskapen til å danne acinar-lignende strukturer når de seedes i en kjellermembranmatrise. Vi viser at TUM622 acini i 3D-kokultur rekapitulerer viktige trekk ved vevsarkitektur under LUSC-progresjon, samt de dynamiske interaksjonene mellom LUSC-celler og komponenter i tumormikromiljøet (TME), inkludert de ekstracellulære matrise (ECM) og kreftassosierte fibroblaster (CAFs). Vi tilpasser vår viktigste 3D-ponturprotokoll ytterligere for å demonstrere hvordan dette systemet kan brukes til ulike nedstrømsanalyser. Samlet sett skaper denne organoidmodellen en biologisk rik og tilpasningsdyktig plattform som gjør det mulig å få innsikt i celle-iboende og extrinsic mekanismer som fremmer forstyrrelsen av epitelarkitekturer under karsinomprogresjon og vil hjelpe søket etter nye terapeutiske mål og diagnostiske markører.
Introduction
Lungekreft er den viktigste årsaken til kreftrelatert dødelighet over hele verden. Lungeplatecellekarsinom (LUSC), som er den nest vanligste typen ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og står for ca. 30 % av all lungekreft, diagnostiseres ofte ved avanserte stadier og har en dårlig prognose1. Behandlingsalternativer for LUSC-pasienter er et stort udekket behov som kan forbedres ved en bedre forståelse av de underliggende cellulære og molekylære mekanismene som driver LUSC tumorigenesis.
Som med de fleste menneskelige kreftformer, er patogenesen av LUSC preget av forstyrrelsen av den intakte, velbestilte epitelvevsarkitekturen2. Under denne prosessen går riktig apikal-basalcellepolaritet, cellecelle- og cellematrisekontakter tapt, noe som tillater ukontrollert vekst og invasiv oppførsel av tumorcellene. Det er nå allment verdsatt at de ondartede egenskapene til kreftceller ikke kan manifesteres uten et viktig samspill mellom kreftceller og deres lokale tumormikromiljø (TME)3. Viktige komponenter i TME inkludert ekstracellulær matrise (ECM), kreft-assosierte fibroblaster (CAFs) samt endotelceller og infiltrere immunceller aktivt forme TME og driver tumorigenesis4. Likevel er vår nåværende forståelse av hvordan tumorcellene og disse nøkkelkomponentene i TME samhandler for å drive vevarkitektoniske endringer under LUSC-progresjon svært begrenset.
Tredimensjonal (3D) kultur er et viktig verktøy for å studere de biologiske aktivitetene til celle-iboende og extrinsic endringer i regulering av vev arkitektoniske endringer i både normalt og sykt vev5. 3D-kulturer gir riktig strukturell og funksjonell kontekst som vanligvis mangler i tradisjonelle todimensjonale (2D) kulturer. De ekstra dimensjonene av slike systemer etterlignevev i vivo i mange aspekter av cellefysiologi og cellulær atferd, inkludert spredning, differensiering, migrasjon, proteinuttrykk og respons på narkotikabehandling. De siste årene har innsats fra ulike laboratorier ført til utvikling av in vitro 3D-modeller for både normal lunge samt NSCLC6,,7,8. Imidlertid var en modell for lungeplatekarsinom som kan rekapitulere både de dynamiske vevarkitektoniske endringene under tumorigenese samt innlemme viktige stromalkomponenter utilgjengelig.
Her beskriver vi metodene for å etablere et nytt 3-dimensjonalt (3D) kokultursystem ved hjelp av primære PDX-avledede LUSC-celler (kalt TUM622) og CAFs9,10. Både TUM622 og CAFs er avledet fra NSCLC pasient med dårlig differensierte svulster10. Når den er innebygd som enkeltceller i ECM, har en sjelden underpopulasjon av TUM622-celler kapasitet til å danne organoider med acinar-lignende strukturer som viser riktig apikal-basal cellepolaritet. Disse acinar-lignende strukturer er hyperplastisk, viser heterogene uttrykk for stammelignende og differensieringmarkører som ligner på den opprinnelige svulsten mens de forblir ikke-invasive, og dermed etterligner den tidligste fasen av LUSC-utvikling. Viktigere, viste vi at vevsarkitekturen til acinar-lignende strukturer kunne endres ved hemming av celle-iboende signalveier med små molekylhemmere eller tillegg av viktige komponenter i ECM som CAFs, hvorav sistnevnte forbedrer acini-formasjonen og ytterligere provoserer acinien til å bli invasiv når de er i nærheten. Sammen tyder disse dataene på at dette 3D-kokultursystemet av LUSC-organoider gir en verdifull plattform for utredning av den dynamiske gjensidigheten mellom LUSC-celler og TME og kan tilpasses for å overvåke responsen fra LUSC-celler til narkotikabehandling11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Svulster er heterogene vev som består av kreftceller som er sameksisterende side om side med stromale celler som kreftassosierte fibroblaster, endotelceller og immunceller i ECM. Sammen krysser disse ulike komponentene og påvirker tumormikromiljøet, og spiller en aktiv rolle i å drive tumorigenesis, en prosess som innebærer progressive endringer i tumorarkitektur. Ideelt sett bør en in vitro-modell av tumorutvikling kunne fange de dynamiske vevsarkitektoniske endringene observert i menneskelige svulster in vivo, de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Magali Guffroy, John Kreeger og Stephani Bisulco fra Pfizer-Oncology Histopathology and Biomarker group for patologi/histologistøtte og Michael Arensman for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi takker også Pfizer Postdoctoral Program og Oncology R&D-gruppen, spesielt Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin og Jennifer Tejeda for deres støtte til programmet.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
