Testing av målrettede behandlinger mot kreft ved hjelp av strukturell DNA-endringsanalyse og pasientavledede Xenografts
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å teste effekten av målrettede terapier valgt basert på genomisk sminke av en svulst. Protokollen beskriver identifisering og validering av strukturelle DNA-omorganiseringer, engraftment av pasientenes svulster i mus og testing av tiltak mot tilsvarende legemidler.
Abstract
Vi presenterer her en integrerende tilnærming for testing av effekt av målrettede terapier som kombinerer neste generasjons sekvensering av technolo-gies, terapeutiske målanalyser og overvåking av legemiddelrespons ved hjelp av pasientavledede xenografts (PDX). Denne strategien ble validert ved hjelp av ovarietumorer som et eksempel. Mate-pair neste generasjon sekvensering (MPseq) protokollen ble brukt til å identifisere strukturelle endringer og etterfulgt av analyse av potensielt målrettede endringer. Menneskelige svulster dyrket i immunkompromitterte mus ble behandlet med legemidler valgt basert på genomiske analyser. Resultatene viste en god sammenheng mellom de forventede og observerte svarene i PDX-modellen. Den presenterte tilnærmingen kan brukes til å teste effekten av kombinasjonsbehandlinger og hjelpe personlig behandling for pasienter med tilbakevendende kreft, spesielt i tilfeller der standardbehandling svikter, og det er behov for å bruke legemidler av etiketten.
Introduction
Pasientavledede xenografts (PDXs), som genereres fra implantasjon av pasientsvulststykker til immundefeksiale mus, har dukket opp som en kraftig preklinisk modell for å hjelpe personlig anti-kreftbehandling. PDX-modeller er utviklet for en rekke menneskelige maligniteter. Disse inkluderer brystkreft og eggstokkreft, malignt melanom, kolorektal kreft, bukspyttkjertelanokarsinom og ikke-småcellet lungekreft1,,2,,3,,4,5. Tumorvev kan implanteres ortopotopisk eller heterotopisk. Den tidligere, ansett som mer nøyaktig, men teknisk vanskelig, innebærer transplantasjon direkte inn i organet av tumoropprinnelse. Disse typer modeller antas å nøyaktig etterligne histologi av den opprinnelige svulsten på grunn av den “naturlige” mikromiljø for svulsten6,7. For eksempel resulterte ortotopisk transplantasjon i bursa av mus eggstokken i tumorspredning i bukhulen og produksjon av ascites, typisk for eggstokkreft8. På samme måte påvirket injeksjon av brystsvulster i thoraxen i stedet for bukm mammarykjertelen PDX-suksessraten ogatferden 9. Imidlertid krever ortotopiske modeller sofistikerte bildesystemer for å overvåke tumorvekst. Heterotopisk implantasjon av solid svulst utføres vanligvis ved å implantere vev i den subkutane flanken av en mus som gir lettere overvåking av tumorvekst og er billigere og tidkrevende7. Imidlertid dyrket svulster subkutant sjelden sjelden i motsetning til som observert i tilfelle av ortotopisk implantasjon10.
Suksessraten for engraftment har vist seg å variere og er sterkt avhengig av tumortypen. Mer aggressive svulster og vevsprøver som inneholder en høyere prosentandel av tumorceller ble rapportert å ha bedre suksessrater12,13. I samsvar med dette ble svulster avledet fra metastatiske steder vist å engraft ved frekvenser på 50-80%, mens de fra primære steder engraft på frekvenser så lavt som 14%12. I motsetning, vev som inneholder nekrotiske celler og færre levedyktige tumorceller engraft dårlig. Tumorvekst kan også fremmes ved tilsetning av kjellermembranmatriseproteiner i vevsblandingen på tidspunktet for injeksjonen i mus14 uten at det går på bekostning av den opprinnelige svulstens egenskaper. Størrelsen og antall vevsbiter beregnet for implantasjon ble også funnet å påvirke suksessraten for engraftment. Større tumor take-rater ble rapportert for implantasjon i sub-nyrekapselen sammenlignet med subkutan implantasjon på grunn av evnen til sub-nyrekapselen for å opprettholde den opprinnelige svulst stroma og gi verten stromal celler samt15.
De fleste studier bruker NOD/SCID immundefeksinasjonsmus, som mangler naturlige morderceller16 og har vist seg å øke tumoren, veksten og metastasen sammenlignet med andre stammer14. Ytterligere overvåking er imidlertid nødvendig da de kan utvikle thymiske lymfomer så tidlig som 3-4 måneder i alderen13. I ovarietumortransplantasjoner dyrket i SCID-mus, ble utveksten av B-celler vellykket hemmet av rituksimab, og forhindret utvikling av lymfomer, men uten å påvirke engraftment av ovarietumorer17.
Mer nylig, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mus, bærer en null mutasjon i genet koding interleukin 2 reseptor gamma kjede18, ble en ofte brukt belastning for generering av PDX-modeller. Svulster fra etablerte PDX-modeller som er til fremtidige generasjoner av mus, rapporteres å beholde histologiske og molekylære egenskaper i 3 til 6 generasjoner19,,20. Tallrike studier har vist at behandlingsutfallene i PDX-modeller etterligner de av deres tilsvarende pasienter2,3,4,21,22,23. Responsraten på kjemoterapi i PDX-modeller for ikke-små lungekreft- og kolorektalkarsinomer var lik den i kliniske studier for de samme legemidlene24,25. Studier utført i PDX-modeller, utviklet for pasienter som er inkludert i kliniske studier, viste respons på testede legemidler som ligner de som ble observert klinisk hos tilsvarende pasienter2,,3,,4.
Genomiske analyser med høy gjennomstrømning av en pasientsvulst sammen med PDX-modeller gir et kraftig verktøy for å studere korrelasjoner mellom spesifikke genomiske endringer og en terapeutisk respons. Disse er beskrevet i noen få publikasjoner26,27. For eksempel, terapeutiske responser på EGFR-hemmeren cetuximab i et sett med kolorektal PDX-modeller som bærer EGFR-forsterkning, parallelle kliniske responser på cetuximab hos pasienter28.
Det er noen utfordringer knyttet til utvikling og anvendelse av PDX-modeller. Blant disse er tumor heterogenitet29,30 som kan kompromittere nøyaktigheten av behandling respons tolkning som en enkelt celle klone med høyere proliferativ kapasitet i en PDX kan vokse de andre31, og dermed resulterer i tap av heterogenitet. I tillegg, når enkelt tumorbiopsier brukes til å utvikle PDX, kan noen av cellepopulasjonene bli savnet og vil ikke bli representert i det endelige transplantatet. Flere prøver fra samme svulst anbefales for implantasjon for å løse dette problemet. Selv om PDX svulster har en tendens til å inneholde alle celletyper av den opprinnelige donorsvulsten, blir disse cellene gradvis erstattet av de av murin opprinnelse3. Samspillet mellom murine stroma og menneskelige tumorceller i PDX-modeller er ikke godt forstått. Likevel ble stromale celler vist å rekapitulere tumor mikromiljø33.
Til tross for disse begrensningene er PDX-modellene fortsatt blant de mest verdifulle verktøyene for translasjonell forskning samt personlig medisin for valg av pasientbehandling. Store anvendelser av PDXs inkluderer biomarkør oppdagelse og narkotikatesting. PDX-modeller brukes også med hell til å studere resistensmekanismer og identifisere strategier for å overvinne resistens34,35. Tilnærmingen som er beskrevet i det nåværende manuskriptet gjør det mulig for forskeren å identifisere potensielle terapeutiske mål i menneskelige svulster og å vurdere effekten av tilsvarende legemidler in vivo, hos mus som huser transplanterte svulster som i utgangspunktet var genomisk karakterisert. Protokollen bruker ovarietumorer engrafted intraperitoneally men gjelder for alle typer svulster tilstrekkelig aggressiv til å vokse i mus2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver tilnærmingen og protokollene vi brukte til å gjennomføre en “klinisk studie” i PDX-modeller som utnytter molekylære egenskaper av svulsten som oppnådd ved genomisk profilering for å bestemme det beste valget av legemidler for testing. Flere sekvenseringsplattformer brukes for tiden til genomisk karakterisering av primære svulster, inkludert hele genomsekvensering, RNAseq og tilpassede genpaneler. For høygradig serøs ovariekarsinom er parlamentsmedlemmer for å identifisere strukturelle endringer, DN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmene av Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang og Faye R. Harris, MS, for hjelpen til å gjennomføre eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av Mr. og Mrs. Neil E. Eckles’ Gift til Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- ‘Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
