Тестирование целевых методов лечения рака с использованием структурных анализа изменения ДНК и пациентов, полученных Xenografts
Summary
Здесь мы представляем протокол для проверки эффективности целевых методов лечения, отобранных на основе геномного состава опухоли. Протокол описывает идентификацию и проверку структурных перестановок ДНК, привитие опухолей пациентов в мышей и тестирование ответов на соответствующие препараты.
Abstract
Мы представляем здесь интегративный подход для тестирования эффективности целевых методов лечения, который сочетает в себе следующее поколение секвенирования техноло-ги, терапевтических целевых анализов и мониторинга реакции на лекарства с использованием пациентов, полученных ксенотрансплантатов (PDX). Эта стратегия была подтверждена с использованием опухолей яичников в качестве примера. Протокол последовательности следующего поколения (MPseq) был использован для выявления структурных изменений, после чего был проведен анализ потенциально целевых изменений. Опухоли человека, выращенные у иммунокомпромиссных мышей, лечились препаратами, отобранными на основе геномного анализа. Результаты продемонстрировали хорошую корреляцию между прогнозируемыми и наблюдаемыми реакциями в модели PDX. Представленный подход может быть использован для проверки эффективности комбинированного лечения и оказания помощи персонализированным лечением пациентов с рецидивирующим раком, особенно в тех случаях, когда стандартная терапия не удается и существует необходимость использования лекарств от этикетки.
Introduction
Ксенографты, полученные от пациентов (PDX), которые генерируются в результате имплантации частей опухоли пациента в иммунодефицитных мышей, стали мощной доклинической моделью для оказания персонализированной противораковой помощи. Модели PDX были успешно разработаны для различных злокачественных новообразований человека. К ним относятся рак молочной железы и яичников, злокачественная меланома, колоректальный рак, аденокарцинома поджелудочной железы, и немелкоклеточный рак легких1,2,3,4,5. Опухолевую ткань можно имплантировать ортопедически или гетеротопически. Первый, считается более точным, но технически трудно, включает в себя трансплантацию непосредственно в орган опухоли происхождения. Эти типы моделей, как полагают, точно имитировать гистологию оригинальной опухоли из-за “естественной” микроокружения для опухоли6,7. Например, ортотопическая трансплантация в бурсу яичника мыши привела к распространению опухоли в брюшной полости и выработке асцита, характерного для рака яичников8. Аналогичным образом, инъекция опухолей молочной железы в грудной клетки вместо брюшной молочной железы влияет на уровень успеха PDX и поведение9. Тем не менее, ортопедические модели требуют сложных систем визуализации для мониторинга роста опухоли. Гетеротопная имплантация твердой опухоли обычно выполняется путем имплантации ткани в подкожный фланг мыши, что позволяет легче контролировать рост опухоли и является менее дорогостоящим и трудоемким7. Тем не менее, опухоли, выращенные подкожной, редко метастазируют в отличие от наблюдаемых в случае ортопедической имплантации10.
Было показано, что скорость успешного ирования в него варьируется и в значительной степени зависит от типа опухоли. Более агрессивные опухоли и образцы тканей, содержащие более высокий процент опухолевых клеток, как сообщается, лучше успеха12,13. В соответствии с этим, опухоли, полученные из метастатических сайтов было показано, engraft на частотах 50-80%, в то время как те из первичных сайтов engraft на частотах, как низко как 14%12. В отличие от этого, ткани, содержащие некротические клетки и меньше жизнеспособных опухолевых клеток приопят плохо. Рост опухоли также может быть повышен путем добавления подвала мембраны матричных белков в ткани смеси во время инъекции в мышей14 без ущерба для свойств оригинальной опухоли. Было также установлено, что размер и количество частей тканей, предназначенных для имплантации, влияют на успешность имплантации. Большие опухоли принять ставки были зарегистрированы для имплантации в подпональная капсула по сравнению с подкожной имплантации из-за способности подпонаальной капсулы для поддержания первоначальной стромы опухоли и обеспечить принимающей стромальных клеток, а также15.
Большинство исследований используют NOD / SCID иммунодефицитных мышей, которые не имеют естественных клеток-убийц16 и было показано, что увеличение опухоли engraftment, рост и метастазы по сравнению с другими штаммами14. Тем не менее, дополнительный мониторинг требуется, поскольку они могут развиваться тимимы лимфомы уже в 3-4 месяца в возрасте13лет. В трансплантации опухоли яичников, выращенных у SCID мышей, рост В-клеток был успешно ингибируется ритуксимаб, предотвращая развитие лимфомы, но без влияния на инплантирование опухолей яичников17.
Совсем недавно, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) мышей, неся нулевую мутацию в гене кодирования интерлейкина 2 рецептора гамма-цепи18, стал часто используемым штаммом для поколения моделей PDX. Опухоли от установленных моделей PDX, передавшихся будущим поколенияммышей,как сообщается, сохраняют гистологические и молекулярные свойства в течение 3 до 6 поколений19,20. Многочисленные исследования показали, что результаты лечения в моделях PDX имитируют результаты соответствующих пациентов2,,3,,4,,21,,22,,23. Скорость реакции на химиотерапию в моделях PDX для немалых рака легких и колоректальной карциномы была аналогична той, что в клинических испытаниях для тех же препаратов24,25. Исследования, проведенные в моделях PDX, разработанные для пациентов, зачисленных в клинические испытания, продемонстрировали ответы на проверенные препараты, аналогичныетем,которые наблюдаются клинически у соответствующих пациентов2,3,,4.
Геномный анализ опухоли пациента с высокой пропускной способностью в сочетании с моделями PDX является мощным инструментом для изучения корреляций между конкретными геномными изменениями и терапевтической реакцией. Они были описаны в нескольких публикациях26,27. Например, терапевтические реакции на ингибитор EGFR cetuximab в наборе колоректальных моделей PDX, несущих усиление EGFR, параллельные клинические реакции на цетуксимаб у пациентов28.
Есть несколько проблем, связанных с разработкой и применением моделей PDX. Среди них неоднородность опухоли29,30, которые могут поставить под угрозу точность интерпретации реакции лечения в качестве одного клона клетки с более высокой пролиферативной способностью в PDX может перерасти другие31, что приводит к потере неоднородности., Кроме того, когда один биопсии опухоли используются для разработки PDX, некоторые из популяций клеток могут быть пропущены и не будут представлены в окончательном трансплантата. Несколько образцов из одной и той же опухоли рекомендуется для имплантации, чтобы решить эту проблему. Хотя ОПУХОЛи PDX, как правило, содержат все типы клеток первоначальной донорской опухоли, эти клетки постепенно заменяются опухолями муринского происхождения3. Взаимодействие между муринской стромой и опухолевыми клетками человека в моделях PDX не очень хорошо изучено. Тем не менее, стромальные клетки были показаны, чтобы резюмировать микроэквипедииопухоли 33.
Несмотря на эти ограничения, модели PDX остаются одними из наиболее ценных инструментов для трансляционных исследований, а также персонализированной медицины для выбора лечения пациентов. Основные применения PDXs включают биомаркер обнаружения и тестирования на наркотики. Модели PDX также успешно используются для изучения механизмов лекарственной устойчивости и определения стратегий по преодолению лекарственной устойчивости34,,35. Подход, описанный в настоящей рукописи, позволяет исследователю выявлять потенциальные терапевтические цели в опухолях человека и оценивать эффективность соответствующих препаратов in vivo , умышей, укрывающих привитые опухоли, которые изначально были геномно охарактеризованы. Протокол использует опухоли яичников, привитые интраперитонально, но применимы к любому типу опухоли достаточно агрессивным, чтобы расти у мышей2,,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем подход и протоколы, которые мы использовали для проведения «клинических испытаний» в моделях PDX, которые используют молекулярные характеристики опухоли, полученные путем геномного профилирования, чтобы определить лучший выбор препаратов для тестирования. Несколько плат…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Клиники Майо Центр индивидуальной медицины (CIM) д-р Лин Ян и Фэй Р. Харрис, MS, за помощь в проведении экспериментов. Эта работа была поддержана г-н и г-жа Нил Е. Эклс ‘Подарок в клинике Майо Центр индивидуальной медицины (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- ‘Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
