Summary

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Published: January 07, 2020
doi:

Summary

Aqui apresentamos um método multiplexado de sequenciamento de mRNA de célula única para perfilar a expressão gênica em tecidos embrionários de camundongos. O método de sequenciamento de mRNA de célula única baseada em gotículas (scRNA-Seq) em combinação com estratégias multiplexing pode perfilar células únicas a partir de várias amostras simultaneamente, o que reduz significativamente os custos de reagente e minimiza os efeitos experimentais do lote.

Abstract

O sequenciamento de mRNA de célula única tem feito progressos significativos nos últimos anos e tornou-se uma ferramenta importante no campo da biologia do desenvolvimento. Ele tem sido usado com sucesso para identificar populações de células raras, descobrir novos genes marcador, e decodificar informações espaciais e de desenvolvimento temporal. O método de célula única também evoluiu da tecnologia Fluidigm C1 microfluídica para as soluções baseadas em gotículas nos últimos dois a três anos. Aqui usamos o coração como um exemplo para demonstrar como perfilar as células do tecido embrionário do rato usando o método scRNA-Seq baseado em gotículas. Além disso, integramos duas estratégias no fluxo de trabalho para perfilar várias amostras em um único experimento. Usando um dos métodos integrados, temos simultaneamente perfilado mais de 9.000 células de oito amostras de coração. Estes métodos serão valiosos para o campo da biologia do desenvolvimento, fornecendo uma maneira rentável de perfil simultaneamente células únicas de diferentes origens genéticas, estágios de desenvolvimento ou locais anatômicos.

Introduction

O perfil transcricional de cada célula varia entre as populações celulares durante o desenvolvimento embrionário. Embora a hibridação in situ molecular única possa ser usada para visualizar a expressão de um pequeno número de genes1,o sequenciamento de mRNA de célula única (scRNA-Seq) fornece uma abordagem imparcial para ilustrar padrões de expressão em todo o genoma de genes em células únicas. Depois que foi publicado pela primeira vez em 20092,scRNA-Seq foi aplicado para estudar vários tecidos em vários estágios de desenvolvimento nos últimos anos3,4,5. Além disso, como o atlas de células humanas lançou seus projetos focados no desenvolvimento recentemente, mais dados de células únicas de tecidos embrionários humanos devem ser gerados em um futuro próximo.

O coração como o primeiro órgão a desenvolver desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário. O coração consiste em tipos múltiplos da pilha e o desenvolvimento de cada tipo da pilha é temporal e espacial firmemente regulado. Ao longo dos últimos anos, a origem e linhagem celular de células cardíacas em estágios iniciais de desenvolvimento têm sido caracterizadas6, que fornecem uma tremenda ferramenta de navegação útil para a compreensão da patogênese congênita da doença cardíaca, bem como para o desenvolvimento de métodos tecnologicamente mais avançados para estimular a regeneração cardiomiócito7.

O scRNA-Seq passou por uma rápida expansão nos últimos anos8,9,10. Com os métodos recém-desenvolvidos, o projeto e a análise de experimentos unicelulares tornaram-se mais alcançáveis11,12,13,14. O método apresentado aqui é um procedimento comercial baseado nas soluções de gotículas (ver Tabela de Materiais)15,16. Este método apresenta a captura de células e conjuntos de contas de código de barras únicas em uma gota de emulsão de água de óleo controle de um sistema de controlador microfluídico. A taxa de carregamento celular nas gotículas é extremamente baixa, de modo que a maioria das emulsões de gotículas contenha apenas uma célula17. O projeto engenhoso do procedimento vem da separação da única pilha em emulsões da gotícula que ocorrem simultaneamente com código de barras, que permite a análise paralela de pilhas individuais usando RNA-Seq em uma população heterogeneous.

A incorporação de estratégias multiplexing é uma das adições importantes ao fluxo de trabalho tradicional de célulaúnica13,14. Esta adição é muito útil no descarte de dobradores celulares, reduzindo os custos experimentais e eliminando os efeitos do lote18,19. Uma estratégia de código de barras baseada em lipídios e uma estratégia de código de barras baseada em anticorpos (ver Tabela de Materiais)são os dois métodos multiplexing usados principalmente. Códigos de barras específicos são usados para rotular cada amostra em ambos os métodos, e as amostras rotuladas são então misturadas para captura de célulaúnica, preparação da biblioteca e sequenciamento. Posteriormente, os dados de sequenciamento agrupados podem ser separados analisando as sequências de código de barras(Figura 1)19. No entanto, existem diferenças significativas entre os dois métodos. A estratégia de código de barras baseada em lipídios é baseada em oligonucleotídeos modificados por lipídios, que não foram encontrados para ter qualquer preferência do tipo celular. Enquanto a estratégia de código de barras baseada em anticorpos só pode detectar as células que expressam as proteínas de antígeno19,20. Além disso, leva cerca de 10 min para manchar os lipídios, mas 40 min para manchar os anticorpos (Figura 1). Além disso, os oligonucleotídeos modificados por lipídios são mais baratos do que os oligonucleotídeos conjugados com anticorpos, mas não comercialmente disponíveis no momento da escrita deste artigo. Finalmente, a estratégia baseada em lipídios pode multiplex 96 amostras em um experimento, mas a estratégia baseada em anticorpos atualmente só pode multiplex 12 amostras.

O número de células recomendado para multiplex em um único experimento deve ser inferior a 2,5 x 104, caso contrário, levará a uma alta porcentagem de dobradores celulares e potencial contaminação por mRNA ambiente. Através das estratégias multiplexing, o custo de captura de célulaúnica, geração de cDNA e preparação da biblioteca para várias amostras será reduzido ao custo de uma amostra, mas o custo de sequenciamento permanecerá o mesmo.

Protocol

O procedimento animal está de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh (IACUC). 1. Dissecção embrionária do coração do rato e preparação da suspensão da única pilha NOTA: Esta etapa pode levar algumas horas, dependendo do número de embriões para dissecar. Para adquirir corações embrionários E18.5, eutanásia um rato CD1 grávida por administração de CO2. Use uma navalha para r…

Representative Results

Neste estudo, usamos o coração embrionário do camundongo como um exemplo para exibir como o sequenciamento multiplexado de mRNA de célula única foi realizado para processar as diferentes amostras de partes separadas de um órgão simultaneamente. Os corações do rato E18.5 CD1 foram isolados e dissecados no átrio esquerdo (LA), átrio direito (RA), ventrículo esquerdo (LV) e ventrículo direito (RV). As células atrial e ventricular foram então remetidos de forma independente usa…

Discussion

Neste estudo, demonstramos um protocolo para analisar perfis de transcrição de células únicas. Também fornecemos dois métodos opcionais para amostras multiplex no fluxo de trabalho scRNA-Seq. Ambos os métodos provaram ser viáveis em vários laboratórios e forneceram soluções para executar um experimento de célula única sem efeito de custo e lote18,26.

Há alguns passos que devem ser seguidos cuidadosamente ao passar pelo p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a David M. Patterson e Christopher S. McGinnis do laboratório Dr. Zev J. Gartner por seu suprimento gentil dos reagentes de código de barras baseados em lipídios e sugestões sobre as etapas experimentais e análise de dados. Este trabalho foi fundado pelos Institutos Nacionais de Saúde (HL13347202).

Materials

10% Tween-20 Bio-Rad 1610781
10x Chip Holder 10x Genomics 120252 330019
10x Chromium Controller 10x Genomics 120223
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250 230003
10x Vortex Adapter 10x Genomics 330002, 120251
10x Vortex Clip 10x Genomics 120253 230002
4200 TapeStation System Agilent G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 25 nmol
Buffer EB Qiagen 19086
CD1 mice Chales River Strain Code 022 ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R Appendorf 2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns 10x Genomics 1000073 Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10x Genomics 120262 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns 10x Genomics 1000094 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 10x Genomics 1000095 Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads 10x Genomics 2000059 Store at -80 °C
Collagenase A Sigma/Millipore 10103578001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B Sigma/Millipore 11088807001 Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape Agilent 5067-5582 University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL Eppendorf 022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL Eppendorf 022431048
Dynabeads MyOne SILANE 10x Genomics 2000048 Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet Theromo Scientific 12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) Sigma E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning Cellgro 14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States Fisher Scientific 26140079 Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl Theromo Scientific 4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl Theromo Scientific 4661000N
Flowmi Cell Strainer Sigma BAH136800040 Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) Ricca Chemical Company 3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) BioLegend 422301 Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA) Fisher Scientific A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) Fisher Scientific NC0295239 Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) Thermo Fisher Scientific 12090-015
MasterCycler Pro Eppendorf 950W
Nuclease-Free Water (Ambion) Thermo Fisher Scientific AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips Eppendorf 951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium Corning Cellgro 21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) Sigma-Aldrich SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes Fisher Scientific 05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) Beckman Coulter B23318 (60ml)
Template Switch Oligo 10x Genomics 3000228 Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger 10x Genomics https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3 satijalab https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip USA Scientific 1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody BioLegend 155801 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody BioLegend 155803 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody BioLegend 155805 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4% Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Fisher Scientific 25200-056
Universal I5 Integrated DNA Technologies Single-stranded DNA 100 nmol

References

  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
  22. . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
  23. . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
  24. . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)

Play Video

Cite This Article
Feng, W., Przysinda, A., Li, G. Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells. J. Vis. Exp. (155), e60647, doi:10.3791/60647 (2020).

View Video