אינדוקציה של אירוטוזה בתאי דם אדומים באמצעות היואופלפור סידן

Summary

פרוטוקול עבור אינדוקציה של אריטוזה, מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, באמצעות סידן היואופלפור, איקונמיצין, מסופק. הערכה מוצלחת מוערכת על-ידי ניטור פוספוליזה של הלוקליזציה בעלון החיצוני של הממברנה. הגורמים המשפיעים על הצלחת הפרוטוקול נבדקו ותנאים אופטימליים שסופקו.

Abstract

האריציטוזה, מוות מתוכנת באמצעות אריתרופוציטים, מתרחש במספר מחלות המטאולוגיות ובמהלך הפגיעה באריתרופותאי. הסימן ההיכר של התאים eryptotic הוא אובדן של הקובית סימטריה של קרום התא, המוביל הטרנסלוקציה של פוספארידילסרין אל העלון החיצוני קרום. תהליך זה מופעל על ידי ריכוז תאיים מוגבר של Ca^{2 +}, אשר מפעיל את הסמבלאז, אנזים המקל על התנועה הדו של פוספוליפידים בין עלונים ממברנה. בהתחשב בחשיבות הארגטוזה בתנאים נגועים שונים, היו מאמצים לגרום לארגטוזה בתוך מבחנה. מאמצים כאלה בדרך כלל להסתמך על הסידן היואופלפור, איקונמיצין, כדי לשפר את Ca תאיים^{2 +} ריכוז ולגרום אריפיסיס. עם זאת, אי-התאמות רבים דווחו בספרות לגבי ההליך לגרימת שימוש באיקונמיצין. להלן, אנו מדווחים על פרוטוקול צעד אחר צעד לאיקונמיצין-המושרה באמצעות אריתרופוציטים אנושיים. אנו מתמקדים בצעדים חשובים בהליך, כולל ריכוז ביופור, זמן דגירה, ומחסור בגלוקוז, ולספק תוצאה מייצגת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאפשר באופן מידי לגרום הארגיוסיס במעבדה.

Introduction

מוות תאים מתוכנת ב אריתרופוציטים, הידוע גם בשם eryptosis, הוא נפוץ בתנאים קליניים רבים הפרעות המטולוגית. Eryptosis קשורה להתכווצות התאים ואובדן פוספוליפיד-סימטריה בקרום פלזמה התא^1,2. אובדן של א. א. א. תוצאות ב רוברטסוניים של זרחן (PS), שומנים בדרך כלל מקומי בעלון הפנימי^3,4, אל העלון החיצוני התא, אשר אותות מקרופאגים כדי phagocytose ולהסיר אריתרופוציטים פגום^5,6,7,8. בסוף תוחלת החיים הנורמלית של אריתרופוציטים, הסרת התאים eryptotic על ידי מקרופאגים מבטיח את האיזון של אריתרופוציטים במחזור הדם. עם זאת, בתנאים חולים, כגון מחלת תאים מגל ו תלסמיה^9,10,11, eryptosis משופרת עלולה לגרום לאנמיה חמורה². בשל חשיבותו במחלות המטולוגית, יש עניין משמעותי בבדיקת הגורמים העלולים להיות מעכבים או לעכב את המנגנונים המולקולריים ואת המנגנון המולקולרי שבבסיס תהליך זה.

קרום הפלזמה של אריתרופוציטים בריאים הוא אסימטרי, עם שונים פוספוליפידים לוקליזציה על העלונים החיצוניים והפנימיים. א-סימטריה ממברנה מוסדר בעיקר על ידי פעולה של אנזימים ממברנה. Aminophospholipid טרנסלוקייס מקלה על ההובלה של aminophospholipids, PS ו פוספולידילטהולאמין (PE), על ידי הנחיית שומנים אלה אל העלון הפנימי של התא. מצד שני, floppase מסיע את כולין המכיל פוספוליפידים, זרחן (PC) ו ספינגומיילין (SM), מן הפנימי אל העלעל החיצוני של קרום התא¹². עם זאת, בניגוד לתאים בריאים, קרום של האריתרופוציטים eryptotic מעורבל. הדבר נובע מהפעולה של אנזים שלישי, השבלקלז, אשר משבש פוספוליפיד על אי-סימטריה על ידי הקלה על ההובלה הדו-כיוונית של aminophospholipids^13,14,15,16. הסמבלאז מופעל על ידי רמות תאיים גבוהות של Ca^{2 +}. לכן, סידן ionophores, אשר להקל על ההובלה של Ca^{2 +} על פני קרום התא¹², הם השראות יעיל של אריפיסיס.

איקונמיצין, סידן מיואופלפור, נעשה שימוש נרחב כדי לגרום לאריטוסיס ב אריתרופוציטים^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. איקונמיצין יש גם קבוצות ידרופילי ו הידרופובי, אשר נחוצים כדי לאגד וללכוד Ca^{2 +} יון, ולהעביר אותו לחלל ציטוסולג^27,28,29. הדבר מוביל להפעלת הסמבלאז והטרנסלוקציה של PS לעלעל החיצוני, שניתן לאתרם בקלות באמצעות השימוש ב-אנסי-V, חלבון תאי בעל זיקה גבוהה ל-PS¹². למרות שמפעיל את האירוטוזה על ידי איקונמיצין מדווחים בדרך כלל, יש אי-התאמה ניכרת בשיטה בספרות (שולחן 1). האוכלוסייה של אריתרופוציטים שעברו אריטוציטוזה תלוי בגורמים שונים כגון ריכוז ביוופפור, זמן טיפול עם היופופור, ואת תכולת הסוכר של הסביבה המרחפת (גלוקוז המחסור מפעיל ערוצי הקטיון ומקל את הכניסה של Ca^{2 +} לתוך שטח cytosolic)^30,31. עם זאת, יש מעט עקביות בגורמים אלה בספרות, מה שמקשה על ביצוע של האריטוסיס בלתי מתורבת.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד כדי לזרז את התהליך של אריתרופוציטים אנושיים. הגורמים המשפיעים על האריטוסיס המצליח כולל Ca^{2 +} ריכוז, ריכוז ביופור, זמן טיפול, וטרום דגירה במאגר מרוקן גלוקוז נבדקים ערכים אופטימליים מדווחים. הליך זה מדגים כי טרום דגירה של אריתרופוציטים במאגר נטול גלוקוז מגדיל באופן משמעותי את אחוז האריטוזה לעומת מאגר המכיל גלוקוז. פרוטוקול זה יכול לשמש במעבדה כדי לייצר האריציטים eryptotic עבור יישומים שונים.

Protocol

כל דגימות הדם האנושיות המשמשות בפרוטוקול המתואר להלן נרכשו כדגימות דה מזוהה. שום אדם לא היה מעורב במישרין. או גויס למחקר הזה יש להשתמש בהנחיות של הצהרת הלסינקי כאשר המחקר כולל נושאים אנושיים. 1. בידוד אריתרופוציט מדם שלם הוסף 500 μL של דם שלם ב חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) (מאו…

Representative Results

אופטימיזציה של הריכוז האיקונמיצין בעוד איקונמיצין נדרש כדי לזרז את האריטוסיס, ריכוזי ionomycin מוגברת יכולים להוביל למוליזיס (כלומר, הליזה של אריתרופוציטים ושחרור של המוגלובין), אשר צריך להימנע. הטיפול של אריתרופוציטים עם 1 μM ionomycin ?…

Discussion

המטרה של הליך זה היא לספק ערכים אופטימליים עבור ריכוז ביופור, זמן הטיפול, וריכוז גלוקוז החילוץ, שהם גורמים חשובים בהבטחת אינדוקציה מוצלחת של האריטוסיס. צעד קריטי בפרוטוקול הוא דלדול הגלוקוז של החילוץ, אשר, למרות חשיבותו, לא הודגש מספיק בספרות. תכולת הסוכר בפתרון הצלצול הרגיל (5 מ”מ) היא בעלת …

Materials

96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use