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Biochemistry

カルシウムイオノフォアを用いた赤血球中の赤血球誘導

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/60659
Automatic Translation
1, 1,2
1Biomedical Engineering Program, Ohio University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University

Summary

赤血球の誘導のためのプロトコルは、赤血球における細胞死をプログラムし、イオノフォアカルシウム、イオノマイシン、を使用して、提供される。成功したエリプトーシスは、膜外葉ペレット中の局在ホスファチジルセリンをモニタリングすることによって評価される。プロトコルの成功に影響を与える要因が検討され、最適な条件が提供されています。

Abstract

赤血球は、細胞死をプログラムし、多くの血球疾患および赤血球への損傷の間に起こる。赤血球の特徴は、細胞膜の組成非対称性の喪失であり、膜外葉にホスファチジルセリンの転座につながる。このプロセスは、膜リーフレット間のリン脂質の双方向移動を促進する酵素であるスクランバゼを活性化するCa2+の細胞内濃度の増加によって引き起こされます。様々な疾患状態における赤血球症の重要性を考えると、インビトロで赤血球症を誘発する取り組みが行われてきた。このような努力は、一般に、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、細胞内Ca2+濃度を増強し、赤血球症を誘発することに依存してきた。しかしながら、ヨーノマイシンを用いてエリプトーシスを誘導する手順に関して、文献には多くの不一致が報告されている。本明細書では、ヒト赤血球におけるイオノマイシン誘発性赤血球に対する段階的なプロトコルを報告する。イオノフォア濃度、インキュベーション時間、グルコース枯渇などの重要なステップに焦点を当て、代表的な結果を提供します。このプロトコルは、実験室で再現的に赤血球症を誘発するために使用することができる。

Introduction

赤血球のプログラム細胞死は、赤血球とも呼ばれ、多くの臨床状態および血腫性疾患で一般的である。赤血球症は、細胞形質膜1、2における細胞収縮およびリン脂質非対称性の喪失に関連する。非対称性の喪失は、通常内側リーフレット3、4に局在する脂質であるホスファチジルセリン(PS)を細胞外リーフレットに転位させ、マクロファージにシグナルを送り、欠陥のある赤血球5、6、7、8を除去する。赤血球の正常寿命の終わりに、マクロファージによる赤血球の除去は、循環中の赤血球のバランスを保証する。しかしながら、鎌状赤血球症およびサラセミア9、10、11などの疾患状態では、赤血球症の増強が重症貧血2をもたらし得る。血行性疾患における重要性から、赤血球症を誘発または阻害する因子と、この過程の基礎となる分子機構を調べることに大きな関心がある。

健康な赤血球の形質膜は非対称であり、異なるリン脂質が外側と内側のリーフレットに局在する。膜非対称性は、主に膜酵素の作用によって調節される。アミノリン脂質トランスロカーゼは、アミノリン脂質、PSおよびホスファチジルエタノールアミン(PE)の輸送を促進し、これらの脂質を細胞内リーフレットに導くことによって。一方、フロフパーゼは、リン脂質を含むコリンを輸送し、ホスファチジルコリン(PC)およびスフィンゴミエリン(SM)を、細胞膜12の内側から外側のリーフレットに輸送する。しかし、健康な細胞とは異なり、赤球の膜はスクランブルされます。これは、第3の酵素の作用によるもので、スクランバゼは、アミノリン脂質13、14、15、16の双方向輸送を促進することによりリン脂質非対称性を破壊する。スクランマゼは、Ca2+の高い細胞内レベルによって活性化される。従って、細胞膜12を横切るCa2+の輸送を容易にするカルシウムイオノフォアは、赤血球症の効率的な誘導剤である。

イオノマイシンは、イオノフォアカルシウムであり、赤血球12、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26で赤血球中の赤血球を誘導するために広く使用されている。イオノマイシンは、Ca2+イオンを結合および捕捉し、それを細胞質空間27、28、29に輸送するために必要な親水性基および疎水性基の両方を有する。これは、スクランブラーゼの活性化およびPSの外側リーフレットへの転位につながり、これは、PS12に対する親和性が高い細胞タンパク質であるアネキシンVを用いて容易に検出することができる。イオノマイシンによるエリプトーシスの誘発は一般的に報告されているが、文献にはかなりの方法の不一致がある(表1)。赤血球の集団は、イオノフォア濃度、イオノフォアによる治療時間、および細胞外環境の糖度(グルコース枯渇がカチオンチャネルを活性化し、細胞質空間へのCa2+の侵入を容易にする)30、31などの異なる要因に依存する。しかし、文献ではこれらの因子にはほとんど一貫性がなく、インビトロで再現的に赤血球症を行うことが困難である。

このプロトコルでは、ヒト赤血球において赤血球を誘導する段階的な手順を提示する。Ca2+濃度、イオノフォア濃度、治療時間、グルコース枯渇緩衝液中のプレインキュベーションを含む成功したエリプトーシスに影響を与える因子を調べ、最適な値が報告される。この手順は、グルコースフリー緩衝液中の赤血球のプレインキュベーションが、グルコース含有緩衝液と比較して赤血球症の割合を有意に増加することを示す。このプロトコルは、様々な用途に対して赤血球を作製するために実験室で使用することができます。

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Protocol

以下に説明するプロトコルで使用されるすべてのヒト血液サンプルは、非同定サンプルとして購入された。この研究に直接関与したり募集したりしたヒト被験者は一人もいない。ヘルシンキ宣言のガイドラインは、研究が人間の被験者を含む場合に使用する必要があります。

1. 全血からの赤血球分離

  1. 酸クエン酸デキストロース(ACD)に500μLの全血を加え(4°Cで保存)、マイクロ遠心管に加えます。
    注:全血はACDで購入されました。同社によると、1.5 mLのACDが全血7mL(総量8.5mL)に添加される。
  2. 室温(RT)で700 x gで全血を遠心分離し、ピペットを使用して透明なプラズマと薄いバフィーコートを取り除き、赤赤血球層を残します。
  3. 125 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO4、32mM HEPES、5 mM グルコース、および 1 mM CaCl2を含むリンガー溶液の1 Lを調製する。1.0 M NaOHの2 μLドロップを加えて、pHを7.4に調整します。グルコースフリーリンガー溶液を調製するには、同じプロトコルに従うが、溶液中にグルコースを含めない。
  4. リンジャー溶液の1.5 mLで細胞ペレットを一時停止し、RTで700 x gで遠心分離し、上清を除去して、リンジャー溶液中の赤血球2xを洗浄する。
  5. 赤血球ペレットの40°Lを9,960°Lのグルコースフリーリンガー溶液に再サスペンドして0.4%ヘマトクリットを作り、最終体積10mLに達します。
    注:ヘマトクリットは、懸濁液中の赤血球の体積分率を指すために使用される用語です。0.4%ヘマトクリットは、0.4%赤血球を含む懸濁液である。
  6. 細胞懸濁液を37°Cで7日間インキュベートする。

2. イオノマイシンによる赤血球の治療とヘモリシスの測定

  1. ジメチルスルホキシド(DMSO)の630μLに1mgのイオノマイシンカルシウム塩を溶解し、2mMの最終濃度に達する。アリコートと-20°で保存します。
  2. ステップ1.5から0.4%ヘマトクリットの1mLを取り、2 mMイオノマイシンの0.5 μLを加えて、37°Cで2時間インキュベートする1μMの最終濃度に達します。
    1. マイナス対照としてヨオノマイシン治療を行わずにヘマトクリットの1mLを使用する。
  3. RTで700 x gでイオノマイシン処理および未処理のヘマトクリットを5分間遠心分離し、上清を取り除き、細胞ペレットをチューブの底に残します。
  4. リンジャー溶液の1.5 mLで細胞ペレットを中断し、RTで700 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄することにより、リンジャー溶液で細胞を3倍洗浄します。
  5. 血液分析を測定するには、ステップ1.5から未処理の0.4%ヘマトクリットをマイクロ遠心管に1mL加え、経血症の陰性対照として37°Cで2時間インキュベートします(0%)。
  6. ステップ1.5から未処理の0.4%ヘマトクリットをマイクロ遠心管に1mL、RTで700 x gで5分間の遠心分離機を加え、上清を取り除き、細胞ペレットに蒸留水を1mL加え、ヘモリシス(100%)の陽性対照として37°Cで2時間インキュベートします。
  7. ステップ2.2からマイクロ遠心管にイオノマイシン処理0.4%ヘマトクリットを1mL加えます。
  8. 未処理の細胞、処理された細胞、および蒸留水中の細胞を700xgでRTで5分間遠心分離する。
  9. 上清の200°Lを取り、96ウェルプレートに追加します。
  10. マイクロプレートリーダーを使用して541nmで吸光度を測定します。
  11. 方程式 132を使用して解熟を計算します。

    %ヘモライシス = (AT - A0)/(A100 - A0)*100

    ここで、A 0はリンガー溶液中の赤血球の吸光度、A100は水中の赤血球の吸光度、ATはイオノマイシンによる治療された赤血球の吸光度である。

3. アネキシン-V結合アッセイ

  1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の8mLにおける5xアネキシンV結合緩衝液の希釈2mLを、1x結合緩衝液を得た。
  2. 1x結合緩衝液の1mLでステップ2.4からイオノマイシン処理および未処理の細胞ペレットを再中断する。
  3. 結合バッファー内の細胞懸濁液の235 μLを取り、アネキシンV-Alexa Flour 488コンジュゲートの15°Lを追加します。
  4. 暗い場所で20分間RTで細胞をインキュベートします。RTで5分間700 x gで遠心分離し、上清を取り除く。
  5. 細胞2xを1x結合緩衝液で洗浄し、結合緩衝液の1.5mLで細胞ペレットをサスペンドし、RTで700xgで5分間遠心分離し、上清を除去する。
  6. フローサイトメトリー測定のために、1x結合バッファーの250°Lで細胞ペレットを再サスペンドします。

4. フローサイトメトリー

  1. アネキシンV染色赤血球の200μLを、フローサイトメトリーと互換性のある1mLラウンドボトムポリスチレンチューブに転写する。
  2. フローサイトメトリーソフトウェアにログインし、新しい実験ボタンをクリックします。新しいチューブボタンをクリックします。グローバルシートを選択し、励起波長488nm、発光波長530nmの蛍光強度を測定する適用分析を選択します。
  3. 蛍光活性化細胞選別(FACS)分析のために収集する細胞数を20,000に設定します。
  4. 目的のチューブを選択し、ロードボタンをクリックします。前方散乱と側面散乱の測定のための記録ボタンをクリックします。すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返します。
  5. 標本ボタンを右クリックし、バッチ分析の適用をクリックして結果ファイルを生成します。
  6. 標本ボタンを右クリックし、FSCファイルの生成をクリックします。
  7. フローサイトメトリーソフトウェアの職場にフローサイトメトリーデータ(FSCファイル)を追加します。
  8. 対象のセル集団を選択し、赤血球症値の統計を追加して、制御データを分析します。
    1. コントロールをダブルクリックし、ヒストグラム対蛍光強度を選択します。
    2. ゲートボタンをクリックして、エリプトーシスのパーセンテージを示すヒストグラムにゲートを描画します。
  9. 他のすべての実験管に同じ統計量を適用して、エリプトーシス値を得る。コントロールを右クリックし、[グループ化する分析のコピー] を選択します。
  10. すべてのサンプルを適切にゲーティングした後、分析したデータをレイアウト エディタにドラッグ アンド ドロップして転送します。
    1. レイアウト エディターで、分析されたデータをコントロールにオーバーレイします。
    2. オーバーレイされたグラフの x 軸と y 軸を変更して、目的のヒストグラムと強度を設定します。
    3. [エクスポート]ボタンをクリックして画像ファイルをエクスポートし、グラフを目的の場所に保存します。

5. 共焦点顕微鏡

  1. アネキシンV染色細胞を顕微鏡スライドに5μL転写し、カバースリップで覆います。光の漂白を防ぐために暗い場所に保管してください。
  2. 共焦点蛍光顕微鏡のアルゴンレーザーを使用して、所望の倍率で488nmで励起された細胞を観察します。
    注:共焦点顕微鏡は必ずしも必要ではなく、蛍光機能を備えた顕微鏡を使用して、アネキシンV結合を実証する蛍光画像を得ることができます。
  3. 対照(非処理細胞)および処理された細胞の蛍光画像を得る。
    注:非処理細胞は非常に弱い蛍光シグナルを示すことが期待され、処理された細胞は膜上で明るい緑色蛍光を示すことが期待されます。

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Representative Results

イオノマイシン濃度の最適化

イオノマイシンは赤血球を誘発するために必要であるが、イオノマイシン濃度の増加は、出血(すなわち赤血球の溶解およびヘモグロビンの放出)を避ける必要がある。2時間のリンガー溶液中の1μMイオノマイシンによる赤血球の治療は、アネキシンVアレクサ小麦粉488共役とFACS分析による定量化に成功することによって示されるように、エリプトーシスを誘発するのに十分である(図1A)。イオノマイシンの濃度が高いほど、エリプトーシスがわずかに増加します(図1A-D)。しかしながら、このような濃度はまた、ヘモリシスを増強する(図1E)が望ましくない。5%のヘモリシス以下に保つために、1μMのイオノマイシンを使用する必要があります。

イオノマイシンによる治療時間

リンガー溶液中のイオノマイシンを用いて赤血球をわずか30分間インキュベーションするだけで、赤血球症を誘発するのに十分である(図2A)。インキュベーション時間の増加は、アネキシンV結合アッセイによって測定されるエリプトーシスのレベルを増加させ、最大2時間(図2B,C)に及ぶ。しかし、さらにインキュベーション時間は、赤血球症のレベルのわずかな低下をもたらす(図2D)。最大エリプトーシスは、1μMイオノマイシンによる治療の2時間後に得られ、その他すべての治療時間について、より低い赤血球症が得られた(図2E)。代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを図2A-Dに示す。加えて、平均エリプトーシスおよびヘモリシスの割合は、1μMイオノマイシンによる種々の治療時間について、それぞれ図2Eおよび図2Fに示されている。180分後のヘモリシスの高い値は、同じ量のインキュベーション後の赤血球の減少を説明する(図2E)。

また、細胞を0、0.25、0.5、1μMを含む低濃度のイオノマイシンで処理し、6時間及び12時間を含むより長い処理時間を測定し、エリプトーシスを測定した(図3)。6および12時間の1μMより低いイオノマイシン濃度で処理された細胞は、1μMイオノマイシンで処理された細胞と比較して低いエリプトーシスを示す(図3)。濃度を低下させ、露光時間を増加させることは赤血球症を増強しなかったため、1μMを用いて赤血球症を引き起こした。

赤血球症はインキュベーション時間と細胞外グルコース濃度に依存する

細胞外グルコース濃度は、プロセスの結果に影響を与えます。赤血球がグルコースフリーリンガー溶液でプレインキュベートされると、1μMイオノマイシンを2時間インキュベーションする前にグルコース含有リンガー溶液と比較して、より高い赤血球値が観察されます。最も高い赤血球症値は、両方の溶液で7日間のプレインキュベーションの後に得られます。しかし、5mMのグルコースを含む通常のリンガー溶液と比較して、グルコースフリーリンガー溶液中のプレインキュベーション後のエリプトーシスは高い(図4Aは代表的なプロットとグローバル手段の比較のための図4Bを参照)。また、前方散乱ヒストグラムは、赤血球収縮に対するグルコース枯渇の影響を示す(図5A-D)。前方散乱は、光屈折に基づくセルサイズの尺度であり、散乱する光のレベルは、セル33のサイズに正比例する。グルコースフリーリンガー溶液中でインキュベートされた細胞は、グルコース含有緩衝液(図5E)でインキュベートされた細胞に比べて前方散乱が少ないことを示し(図5E)、グルコースフリー環境における細胞収縮を示す。

フローサイトメトリー測定に加えて、共焦点蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、赤血球症を確認した。治療を行わずに赤血球(図6A)およびイオノマイシン処理(図6B)を用いて、アネキシンVアレクサ小麦粉488共役で標識し、顕微鏡下で観察した。処理された細胞は、外側リーフレットにおけるアネキシンVとPSの結合に起因する明るい蛍光シグナル(図6B)を示した。対照的に、治療を行っていない細胞は、非常に低い赤血球症を示す非常に弱い蛍光シグナル(図6A)を示した。さらなる蛍光シグナルを有するアネキシンVで標識された赤血球の画像の例を図6Cに示す。

Figure 1
図1:様々なイオノマイシン濃度がエリプトーシスおよびヘモリシスに及ぼす影響の代表的なグラフ。(A)1μM、(B)5μM、および(C)10μMイオノマイシン(グレー)で37°Cで処理した赤血球のフローサイトメトリーヒストグラムは、2時間のリンガー溶液中のヘマトクリットを2時間用にヘマトクリット、非処理細胞を示す。紅斑の割合を各図に示す。ホスファチジルセリン曝露は、アネキシンV結合を用いて測定した。(D)算術平均は、2時間の処理後に異なる濃度のイオノマイシンで処理した細胞の赤血球の割合の±SD(n=3)、および(E)演算手段±SD(n=3)の赤血球の異なる濃度による赤血球の溶解を同じ条件下で意味する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:様々なヨーノマイシン治療時間が赤血球症に及ぼす影響に関する代表数値1μMイオノマイシン(灰色)で37°C(A)30分間、(B)60分、(C)120分、および(D)リンガー溶液中の0.4%ヘマトクリットで180分で処理した赤血球のフローサイトメトリーヒストグラム。黒い線は非処理された細胞を示す。紅斑の割合を各図に示す。ホスファチジルセリン曝露は、アネキシンV結合を介して測定した。(E)算術平均±SD(n=3)は、異なる時間に1μMイオノマイシンで処理された細胞のエリプトーシスのパーセンテージの。最も高いエリプトーシスは120分の治療の後に得られた。(F)算術平均±SD(n=3)は、異なる時間に1μMイオノマイシンで処理した細胞の解光率の。統計解析では、クルスカル・ウォリス試験を用いた一方向ノンパラメトリックANOVAを行い、120分の治療後の赤血球症はパネルE.*に示すように対照よりも有意に高かった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:様々なイオノマイシン濃度と治療時間がエリプトーシスに及ぼす影響算術手段±SD(n=3)は、異なる濃度のイオノマイシンで処理された細胞の赤血球症の割合が種々の処理時間後に示される。細胞を0、0.25、0.5、および1μMを含む低濃度のイオノマイシンで処理し、より長い暴露(6時間および12時間)を行った。濃度が高く、治療が長いと、エリプトーシス値が高くなります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:赤血球症に対するエネルギー枯渇の影響(A)1μMイオノマイシン(グレー)で処理した赤血球のフローサイトメトリーヒストグラムを0.4%ヘマトクリットで2時間37°Cで、グルコースフリーリンガー溶液(上図)およびリンガー溶液(下図)で1〜7日間のプレインキュベーション後、エネルギー枯渇が赤血球症を促進することを明らかにする。黒い線は非処理された細胞を示す。赤血球症のパーセンテージは、各日のグラフに示されます。(B)算術平均±SD(n=3)は、リンガー溶液(黒棒)およびグルコースフリーリンガー溶液(白棒)でのプレインキュベーション後、0.4%ヘマトクリットで37°Cで1μMイオノマイシンで処理した赤血球の赤血球の割合の±SD(n=3)を1〜7日の間でリンガー溶液(黒いバー)およびグルコースフリーリンガー溶液(白棒)でプレインキュベーションした後である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:細胞サイズに対するエネルギー枯渇の影響赤血球用の前方散乱ヒストグラムを37°Cで2時間0.4%ヘマトクリットで2時間処理し、グルコースフリーリンガー溶液(グレー)およびリンガー溶液(黒線)で(A)1日間、(B)3日間、(C)5日間、および(D)7日間でプレインキュベーションした後。経時の前方散乱ヒストグラムは、グルコースフリー緩衝液中の赤血球収縮を示す。(E)算術平均±SD(n=3)は、0.4%ヘマトクリットで2時間37°Cで1μMイオノマイシンで処理した赤血球の前方散乱強度の±SD(n=3)、リンガー溶液(黒棒)およびグルコースフリーリンガー溶液(白色棒)で1〜7日間のプレインキュベーション後に行う。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:(A)0μM、(B)及び(C)1μMイオノマイシンで37°Cで0.4%ヘマトクリットで2時間処置した赤血球の共焦点蛍光顕微鏡画像。40x客観的な倍率はパネルAおよびBの画像に使用され、100xの客観的な倍率は、細胞膜の内側のリーフレット上に位置する健康な赤血球中のパネルC.PSの画像を撮るために使用され、したがってパネルAに蛍光シグナルがない。パネルBおよびC赤血球は赤血球症のために誘導されており、アネキシンVとPSの結合から細胞膜の外側のリーフレットに転移した結果として生じる明るい蛍光シグナルがある。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

細胞密度/ヘマトクリット イオノマイシン濃度 バッファー インキュベーション前 イオノマイシンによる治療時間 検出方法 参照
1.65 x 108セル/mL 0.3 mM バッファ A* バッファ A で 36 時間 1 時間 アネキシンV 12
0.40% 1 mM リンガーソリューション リンガーで48時間 1 時間 アネキシンV 17
50% 10 mM バッファ B** - 3 時間 メロチャニン 540 18
0.40% 1 mM リンガーソリューション リンガーで48時間 1 時間 アネキシンV 19
0.40% 1 mM リンガーソリューション リンガーで48時間 1 時間 アネキシンV 20
2% 1 mM リンガーソリューション - 4 時間 アネキシンV 21
0.40% 1 mM リンガーソリューション - 0.5時間 アネキシンV 22
10% 1 mM リンガーソリューション - 3 時間 アネキシンV 23
0.40% 10 mM リンガーソリューション - 0.5時間 アネキシンV 24
0.40% 1 mM リンガーソリューション リンガーで48時間 0.5時間 アネキシンV 25
2 x 106セル/mL 1 mM HEPES緩衝生理線(HBS) - 0.5時間 アネキシンV 26
*バッファA:10 mMヘペス、150 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2・6H2O、10 mMグルコース、および1.8 mM CaCl2・2H2O
**バッファB:5 mMトリス、100 mM KC1、60 mM NaCl、および10 mMグルコース

表1:ヨーノマイシンを用いて赤血球症を誘導するために文献で用いられる種々のプロトコル。

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Discussion

この手順の目的は、エリプトーシスの誘導を成功させるために重要な要因であるイオノフォア濃度、治療時間、および細胞外グルコース濃度に最適な値を提供することです。プロトコルの重要なステップは、細胞外グルコースの枯渇であり、その重要性にもかかわらず、文献では十分に強調されていない。通常のリンガー溶液中の糖度(5mM)は、赤血球症に対する阻害効果を有する。細胞外環境でのグルコース枯渇は、細胞ストレスを誘発し、プロテインキナーゼC(PKC)を活性化し、カルシウムおよびカリウムチャネルの活性化をもたらす。これにより、細胞様空間30、31、34におけるCa2+のエントリが増加し、最終的に赤血球増加するスクランパーゼ16が活性化する。カリウムチャネルの活性化はまた、細胞からの塩化カリウム漏出をもたらし、赤血球収縮35をもたらす。

上記の手順は、ヘモリシスに特定の注意を払って実行する必要があります。エリプトーシスを誘発するのに十分な高さ、およびエリモリシスを防ぐのに十分な低い最適化されたイオノフォア濃度を使用することが重要です。同様に、イオノマイシンを用いて赤血球を短期間インキュベートすると、極めて長いインキュベーションが細胞膜破壊や経理溶解につながる可能性がある一方で、赤血球は低いエリプトーシスをもたらす。また、提示されたプロトコルは、同じ赤血球サンプル上で行うと信頼性が高いが、異なる個体からの細胞はイオノマイシンに対して異なる反応を示し、異なるサンプル間で被験者間変動が生じる可能性があることに留意すべきである。

フローサイトメトリーからのデータ分析には特に注意が必要です。フローサイトメーターから得られた赤血球症の割合は、外側のリーフレットにPSを有する細胞集団の割合を示す。ただし、アネキシンV結合の強度が異なる細胞は、この数に基づいて区別できません。アネキシンVは、細胞表面に露出したPSに結合し、PS36、37、38に対して非常に高い親和性と高い特異性を有する。しかしながら、このレポートの顕微鏡画像に示すように、異なる細胞はアネキシンV結合強度の違いを示す。膜上のPSが低い細胞は蛍光強度が低いのに対し、細胞膜のPS占有率が高いほど蛍光強度が高くなります。

本論文に提示されるプロトコルは、細胞外Ca2+濃度を増加させることによって改変することができる。このプロトコルでは、ヨーノマイシンは1 mM CaCl2の存在下でエリプトーシスを誘導するために使用された;高いCa2+濃度は、細胞内カルシウムレベルの増強につながる可能性があり、より多くの赤血球症を誘発する可能性があります。さらに、セレクトフォアやカルシマイシンなどの異なるカルシウムイオノフォアは、イオノマイシンと比較してCa2+の細胞内濃度を増強する能力が異なる可能性があり、異なるエリプトーシス値をもたらす可能性があります。しかし、赤血球の一貫した赤血球は、概説されたプロトコルを用いてヨーノマイシンを用いて達成することができ、実験室でエリプト症の分子機構を調べるために使用することができ、模倣病状態39、40in vitro、および赤血球を阻害するスクリーニング電位治療薬、および他の用途の間で。

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Disclosures

著者たちは何も開示する必要はない。

Acknowledgments

この作品は、NIH補助金R15ES030140およびNSF補助金CBET1903568によってサポートされました。ラス工科大学とオハイオ大学化学・生体分子工学科からの資金援助も認められています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Fisher Scientific 12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit Fisher Scientific A10788 Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer BD Biosciences 643177
CaCl2 Fisher Scientific C79-500
Centrifuge Millipore Sigma M7157 Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy Zeiss, LSM Tek Thornwood Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles Fisher Scientific 12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube VWR VWRU47729-566
DMSO Sigma-Aldrich 472301-100ML
DPBS VWR Life Science SH30028.02
Glucose monohydrate Sigma-Aldrich Y0001745
HEPES Buffer (1 M) Fisher Scientific 50-751-7290 Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt EMD Milipore Corp. 407952-1MG Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl Fisher Scientific P330-500
MgSO4 Fisher Scientific M65-500
Microcentrifuge tube Fisher Scientific 02-681-5
NaCl Fisher Scientific S271-500
Plain glass microscope slides Fisher Scientific 12-544-4
Synergy HFM microplate reader BioTek
Whole blood in ACD Zen-Bio Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use

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カルシウムイオノフォアを用いた赤血球中の赤血球誘導
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Bigdelou, P., Farnoud, A. M. Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore. J. Vis. Exp. (155), e60659, doi:10.3791/60659 (2020).

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