जेब्राफिश स्पर्मेटोसाइट्स से मेओटिक क्रोमोसोम स्प्रेड की तैयारी
Summary
परमाणु सतह फैलता है meiosis के दौरान गुणसूत्र घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण हैं । यहां हम जेब्राफिश शुक्राणुओं से प्रोफेज I के दौरान मेयोटिक गुणसूत्रों को तैयार करने और कल्पना करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
मेयोसिस यौन प्रजनन के लिए हैप्लॉयड गेमट्स बनाने के लिए आवश्यक प्रमुख सेलुलर प्रक्रिया है। मॉडल जीवों ने मेओटिक प्रोफेज के दौरान होने वाली गुणसूत्र घटनाओं को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जिसमें पेयरिंग, सिनैप्सिस और पुनर्संयोजन घटनाएं शामिल हैं जो उचित गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करती हैं। जबकि माउस इन प्रक्रियाओं में अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल रहा है, इस प्रणाली में सभी मेयोटिक घटनाएं मानव मेयोसिस के अनुरूप नहीं हैं। हमने हाल ही में मानव शुक्राणुओं के मॉडल के रूप में जेब्राफिश की रोमांचक क्षमता का प्रदर्शन किया। यहां हम विस्तार से वर्णन करते हैं, गुणसूत्र प्रसार तैयारी में मेयोटिक गुणसूत्रों और संबद्ध प्रोटीन की कल्पना करने के हमारे तरीके। इन तैयारियों में गुणसूत्र संरचनाओं के उच्च संकल्प विश्लेषण की अनुमति देने का लाभ है। सबसे पहले, हम वयस्क ज़ेब्राफिश से टेस्ट विच्छेदन की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जिसके बाद सेल विसोशन, लिसिस और गुणसूत्रों के प्रसार होते हैं। इसके बाद, हम मेटालु संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस द्वारा इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन, और न्यूक्लिक एसिड दृश्यों द्वारा मेयोटिक गुणसूत्र प्रोटीन के स्थानीयकरण का पता लगाने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इन तकनीकों में जेब्राफिश सिस्टम में मेओटिक क्रोमेटिन वास्तुकला के साइटोलॉजिकल विश्लेषण के लिए उपकरणों का एक उपयोगी सेट शामिल है। जेब्राफिश समुदाय के शोधकर्ताओं को इन तकनीकों में जल्दी से महारत हासिल करने और उन्हें प्रजनन कार्य के अपने मानक विश्लेषणों में शामिल करने में सक्षम होना चाहिए।
Introduction
यौन प्रजनन दो हैप्लॉयड गेमट्स के संयोजन के माध्यम से आगे बढ़ता है, प्रत्येक दैहिक कोशिका के आधे गुणसूत्र पूरक को ले जाता है। Meiosis एक विशेष सेल डिवीजन है जो डीएनए प्रतिकृति के एक दौर और गुणसूत्र अलगाव के लगातार दो दौर के माध्यम से हैप्लॉयड गेमट्स का उत्पादन करता है। प्रोफेज I में, समरूप गुणसूत्र (समरूपता) को पेयरिंग, पुनर्संयोजन और सिनैप्सिस से गुजरना होगा, जिनमें से उत्तरार्द्ध सिनैपटोनल परिसर के गठन की विशेषता है जिसमें ट्रांसवर्स फिलामेंट, सिसीपी1(चित्रा 1ए, बी)द्वारा ब्रिजित दो होमोलॉग कुल्हाड़ी शामिल हैं। इन प्रक्रियाओं को ठीक से निष्पादित करने में विफलता एन्यूप्लाइड गेमट्स के उत्पादन का कारण बन सकती है, जो मनुष्यों में गर्भपात का एक प्रमुख कारणहैं 1। बांधना, पुनर्संयोजन और सिनेप्सिस के बीच समन्वय के बारे में हमारे ज्ञान को खमीर, सी एलिगेंस,माउस और ड्रोसोफिलाजैसे जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में अध्ययन द्वारा सुविधाप्रदान की गई है, जो अन्य2के बीच हैं। जबकि अलगाव के बाद के अनुसार गुणसूत्र बांधना की सामान्य प्रक्रिया अच्छी तरह से संरक्षित है, पुनर्संयोजन और सिनेप्सिस पर इसकी निर्भरता और इन घटनाओं का क्रम भिन्न होता है।
मेओटिक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) गठन, जो समरूप पुनर्संयोजन शुरू करता है, लेप्टोटिन के दौरान गुलदस्ता में संकुल टेलोमेरेस के पास होता है और सिनेप्सिस3,4के तुरंत बाद होता है। डीएसबी गठन और सिनेप्सिस दीक्षा का यह विन्यास मनुष्यों में पुरुष मेयोसिस की एक विशेषता भी है, लेकिन माउस5,6,7,8में नहीं, यह सुझाव देता है कि जेब्राफिश मानव शुक्राणुओं के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकता है। जेब्राफिश मेयोसिस का अध्ययन करने के कई व्यावहारिक फायदे भी हैं। पुरुषों और महिलाओं दोनों वयस्कता के दौरान गेमटोजेनेसिस से गुजरते हैं, उनके गोनाड्स आसानी से सुलभ होते हैं, और सैकड़ों संतान एक ही क्रॉस से उत्पन्न होते हैं। इसके अतिरिक्त, भ्रूण पारदर्शी होते हैं और बाहरी रूप से विकसित होते हैं, जो एन्यूप्लाइड गेमट्स3,9के कारण भ्रूणीय विकास में विपथनों का शीघ्र पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है। जेब्राफिश का उपयोग करने के नुकसान यह हैं कि वे यौन परिपक्वता (~ 60 दिनों) तक पहुंचने के लिए धीमे हैं और परमाणु सतह स्प्रेड के लिए आवश्यक सामग्री की मात्रा उनके आकार के आधार पर ~ 10-20 वयस्क जानवरों से एकत्र की जानी चाहिए।
मेओटिक गुणसूत्र प्रसार तैयारी सभी मॉडल जीवों में गुणसूत्र गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, क्योंकि मेयोटिक गुणसूत्र गतिशीलता के प्रमुख हस्ताक्षरों की जांच की जा सकती है। जेब्राफिश में, मेयोटिक कार्यक्रम और परमाणु संगठन की प्रगति के प्रमुख पहलुओं को परमाणु सतह फैलने की जांच के माध्यम से विच्छेदित किया गया है, जिसे यहां गुणसूत्र स्प्रेड के रूप में संदर्भित किया गया है, जिसमें प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए एंटीबॉडी और/या न्यूक्लिक एसिड मछली3,4,9,10,11,12द्वारा । दरअसल, गुलदस्ता में संकुल टेलोमेरेस के ध्रुवीकृत स्थानीयकरण को प्रसार तैयारी(चित्रा 1 C)में संरक्षित किया जा सकता है। हाल ही में, हमने जेब्राफिश शुक्राणुओं का उपयोग किया है फ्लोरेसेंस डिटेक्शन विधियों और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के साथ जेब्राफिश टेलोमेरे गतिशीलता, समरूप गुणसूत्र बांधना, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक स्थानीयकरण, और प्रमुख मेयोटिक संक्रमण3में सिनेप्सिस की विस्तृत प्रगति को स्पष्ट करने के लिए। यहां हम जेब्राफिश टेस्ट के शुक्राणुओं से गुणसूत्र फैलता तैयार करने के तरीके प्रस्तुत करते हैं और बाद में उन्हें फ्लोरोसेंट पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (पीएनए) जांच के साथ बार-बार टेलोमेरे दृश्यों और गुणसूत्र से जुड़े प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए दाग देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम परमाणु सतह में टेलोमेरेस और गुणसूत्र से जुड़े प्रोटीन के स्थान की जांच करने के तरीकों का वर्णन करते हैं जो जेब्राफिश टेस्ट से अलग शुक्राणुओं से फैलता है । हम उम्मीद करते हैं कि ये विधियां टेस्ट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए ट्रेंट न्यूमैन और मासुदा शरीफी और जेब्राफिश meiocytes से गुणसूत्रों को फैलाने और धुंधला करने के तरीकों को अनुकूलित करने में मदद करने के लिए एक गुयेन का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को NIH R01 GM079115 द्वारा समर्थित किया गया था S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
