Fremstilling av meiotiske kromosomspreader fra sebrafisk spermatocytter
Summary
Kjernefysiske overflatespreader er et uunnværlig verktøy for å studere kromosomhendelser under meiosis. Her demonstrerer vi en metode for å forberede og visualisere meiotiske kromosomer under profase I fra sebrafiskspermatocytter.
Abstract
Meiosis er den viktigste cellulære prosessen som kreves for å lage haploid gametes for seksuell reproduksjon. Modellorganismer har vært medvirkende til å forstå kromosomhendelsene som finner sted under meiotisk profase, inkludert paring, synapsis og rekombinasjonshendelser som sikrer riktig kromosomsegregering. Mens musen har vært en viktig modell for å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse prosessene, er ikke alle meiotiske hendelser i dette systemet analoge med menneskelig meiose. Vi har nylig demonstrert det spennende potensialet til sebrafisken som en modell av human spermatogenese. Her beskriver vi i detalj våre metoder for å visualisere meiotiske kromosomer og tilhørende proteiner i kromosomspredningspreparater. Disse preparatene har fordelen av å tillate høyoppløselig analyse av kromosomstrukturer. For det første beskriver vi prosedyren for å dissekere testiklene fra voksen sebrafisk, etterfulgt av celledissosiasjon, lyse og spredning av kromosomene. Deretter beskriver vi prosedyren for å oppdage lokalisering av meiotiske kromosomproteiner, ved immunofluorescensdeteksjon og nukleinsyresekvenser, ved fluorescens i situ hybridisering (FISH). Disse teknikkene utgjør et nyttig sett med verktøy for cytologisk analyse av meiotisk kromatinarkitektur i sebrafisksystemet. Forskere i sebrafisk samfunnet bør være i stand til raskt å mestre disse teknikkene og innlemme dem i sine standard analyser av reproduktiv funksjon.
Introduction
Seksuell reproduksjon fortsetter gjennom kombinasjonen av to haploid gametes, hver bærer halvparten av kromosomkomplement av en somatisk celle. Meiosis er en spesialisert celledivisjon som produserer haploid gametes gjennom en runde DNA-replikasjon og to påfølgende runder med kromosomsegregering. I profase I må homologe kromosomer (homologer) gjennomgå paring, rekombinasjon og synapsis, hvorav sistnevnte er preget av dannelsen av synaptonemal-komplekset som består av to homologakser brolagt av den tverrgående filamentet, Sycp1 (Figur 1A,B). Unnlatelse av å utføre disse prosessene kan føre til produksjon av aneuploid gametes, som er en ledende årsak til spontanaborter hos mennesker1. Vår kunnskap om koordinering mellom paring, rekombinasjon og synapsis har blitt tilrettelagt av studier i et bredt spekter av organismer, som gjær, C. elegans,mus og Drosophila, blant andre2. Mens den generelle prosessen med homologk kromosom paring etterfulgt av segregering er godt bevart, er avhengigheten av rekombinasjon og synapsis og rekkefølgen på disse hendelsene varierer.
Meiotisk dobbel-strand pause (DSB) formasjon, som initierer homolog rekombinasjon, oppstår nær telomeres klynget i buketten under leptoten og synapsis følger kort tid etter3,4. Denne konfigurasjonen av DSB dannelse og synapsis initiering er også et karakteristisk for mannlig meiosis hos mennesker, men ikke i mus5,6,7,8, noe som tyder på at sebrafisk kan tjene som en modell for menneskelig spermatogenese. Det er også flere praktiske fordeler ved å studere sebrafisk meiosis. Både menn og kvinner gjennomgår gametogenesis gjennom voksen alder, deres gonader er lett tilgjengelig, og hundrevis av avkom genereres fra et enkelt kors. I tillegg er embryoene gjennomsiktige og utvikler seg eksternt, noe som letter tidlig påvisning av avvik i embryonisk utvikling på grunn av aneuploid gametes3,9. Ulemper ved å bruke sebrafisk er at de er trege til å nå seksuell modenhet (~ 60 dager) og mengden materiale som trengs for kjernefysiske overflatespreader må samles inn fra ~ 10-20 voksne dyr, avhengig av deres størrelse.
Meiotiske kromosomspredningspreparater er et viktig verktøy for å studere kromosomdynamikk på tvers av alle modellorganismer, siden viktige signaturer av meiotisk kromosomdynamikk kan undersøkes. I sebrafisk har viktige aspekter ved utviklingen av meiotisk program og kjernefysisk organisasjon blitt dissekert gjennom sondering kjernefysiske overflatespreader, referert til her som kromosomspreader, med antistoffer for immunofluorescensdeteksjon av proteiner og/ eller nukleinsyrer av FISH3,4,9,10,11,12. Faktisk kan polarisert lokalisering av grupperte telomerer i buketten bevares i spredningspreparatet (Figur 1C). Nylig har vi brukt sebrafisk spermatocyte kromosom sprer seg sammen med fluorescens deteksjonsmetoder og superoppløsning mikroskopi for å belyse den detaljerte progresjonen av sebrafisk telomere dynamikk, homologkkromosom paring, dobbel-strand pause lokalisering, og synapsis på viktige meiotiske overganger3. Her presenterer vi metoder for å forberede kromosomsprer fra spermatocytter av sebrafisktestiklene og deretter flekker dem med fluorescerende peptid kjernesyre (PNA) sonder til gjentatte telomersekvenser og immunofluorescensdeteksjon av kromosom assosierte proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi metoder for å undersøke plasseringen av telomerer og kromosom-tilknyttede proteiner i kjernefysisk overflate sprer seg fra spermatocytter isolert fra sebrafisk testikler. Vi forventer at disse metodene vil være anvendelig for analyse av spermatocytter i andre teleostarter med justering av størrelsen på testis.
Mens bare noen få antistoffer har blitt hevet til sebrafisk meiotiske proteiner, har vi hatt suksess ved hjelp av følgende antistoffer hevet til menneskelige (h) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Trent Newman og Masuda Sharifi for kommentarer til manuskriptet og An Nguyen for å bidra til å optimalisere metoder for spredning og flekker kromosomer fra sebrafisk meiocytes. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM079115 tildelt S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
