Beredning av meiotiska kromosom sprider sig från Zebrafish Spermatocytes
Summary
Kärnytan sprider sig är ett oumbärligt verktyg för att studera kromosom händelser under meios. Här demonstrerar vi en metod för att förbereda och visualisera meiotiska kromosomer under profas I från zebrafiskar spermatocyter.
Abstract
Meios is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Modell organismer har varit avgörande för att förstå kromosom händelser som äger rum under meiotiska prophase, inklusive parning, synaps och rekombination händelser som säkerställer korrekt kromosom segregation. Medan musen har varit en viktig modell för att förstå de molekylära mekanismer som ligger till grund för dessa processer, är inte alla meiotiska händelser i detta system analoga med mänsklig meios. Vi visade nyligen zebrafiskens spännande potential som en modell av mänskliga spermatogenes. Här beskriver vi, i detalj, våra metoder för att visualisera meiotiska kromosomer och tillhörande proteiner i kromosom spridning preparat. Dessa preparat har fördelen av att tillåta högupplöst analys av kromosomstrukturer. Först beskriver vi förfarandet för dissekera testiklar från vuxna zebrafiskar, följt av celldissociation, lys och spridning av kromosomerna. Därefter beskriver vi förfarandet för att upptäcka lokalisering av meiotiska kromosomproteiner, genom immunfluorescensdetektion, och nukleinsyra sekvenser, genom fluorescens in situ hybridisering (FISH). Dessa tekniker utgör en användbar uppsättning verktyg för cytologisk analys av meiotisk kromatin arkitektur i zebrafisk systemet. Forskare i zebrafisk samhället bör kunna snabbt behärska dessa tekniker och införliva dem i sina standardanalyser av reproduktiv funktion.
Introduction
Sexuell reproduktion fortsätter genom kombinationen av två haploid gametes, var och en bär hälften av kromosom komplement av en somatisk cell. Meios is a specialized cell division that producerar haploid gametes through one round of DNA replication and two successive rounds of kromosome segregation. I profas I måste homologa kromosomer (homologs) genomgå parning, rekombination och synaps, varav den senare kännetecknas av bildandet av synaptonemal-komplexet som består av två homologa axlar som överbryggas av tvärgående glödtråd, Sycp1(figur 1A,B). Underlåtenhet att korrekt utföra dessa processer kan leda till produktion av aneuploid gametes, som är en ledande orsak till missfall hos människor1. Vår kunskap om samordningen mellan parning, rekombination och synaps har underlättats av studier i ett brett spektrum av organismer, såsom jäst, C. elegans,mus och Drosophila, bland annat2. Medan den allmänna processen för homologk kromosompar följt av segregation är väl bevarad, dess beroende av rekombination och synaps och ordningen på dessa händelser varierar.
Meiotic dubbel-strand break (DSB) formation, som initierar homolog rekombination, sker nära telomerer klustrade i buketten under leptoten och synaps is följer strax efter3,4. Denna konfiguration av DSB bildning och synapsis inledande är också ett kännetecken för manlig meiosis hos människor men inte i mus5,6,7,8, vilket tyder på att zebrafisk kan fungera som en modell för mänskliga spermatogenes. Det finns också flera praktiska fördelar med att studera zebrafisk meiosis. Både män och kvinnor genomgår gametogenesis under hela vuxenålder, deras gonads är lättillgängliga, och hundratals avkommor genereras från ett enda kors. Dessutom är embryona transparenta och utvecklas externt, vilket underlättar tidig upptäckt av avvikelser i embryonal utveckling på grund av aneuploid gametes3,9. Nackdelar med att använda zebrafisk är att de är långsamma med att nå sexuell mognad (~ 60 dagar) och mängden material som behövs för nukleära ytspridningar måste samlas in från ~ 10-20 vuxna djur, beroende på deras storlek.
Meiotic kromosom spridning preparat är ett viktigt verktyg för att studera kromosom dynamik över alla modell organismer, eftersom viktiga signaturer av meiotic kromosom dynamik kan undersökas. I zebrafisk, viktiga aspekter av utvecklingen av meiotic programmet och nukleära organisationen har dissekerats genom sondering nukleära ytspridningar, som här kallas kromosom sprider sig, med antikroppar för immunfluorescens detektion av proteiner och / eller nukleinsyror av FISH3,4,9,10,11,12. I själva verket kan den polariserade lokaliseringen av klustrade telomerer i buketten bevaras i spridningsberedningen (figur 1C). Nyligen har vi använt zebrafisk spermatocyte kromosom sprider sig tillsammans med fluorescens detekteringsmetoder och super-upplösning mikroskopi för att belysa den detaljerade utvecklingen av zebrafisk telomerdynamik, homolog kromosom ihopkoppling, dubbel-strand break lokalisering, och synaps vid viktiga meiotic övergångar3. Här presenterar vi metoder för att förbereda kromosom sprider sig från spermatocyter av zebrafisk testiklar och därefter fläcka dem med fluorescerande peptid nukleinsyra (PNA) sonder till upprepade telomersekvenser och immunfluorescens detektering av kromosom associerade proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi metoder för att undersöka platsen för telomerer och kromosom-associerade proteiner i nukleära ytbehandlar sprider från spermatocyter isolerade från zebrafisk testiklar. Vi förväntar oss att dessa metoder kommer att tillämpas för analys av spermatocyter i andra teleostarter med justering till testisens storlek.
Medan endast ett fåtal antikroppar har höjts till zebrafisk meiotiska proteiner, har vi haft framgång med hjälp av följande antikroppar upp till mänskli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Trent Newman och Masuda Sharifi för kommentarer om manuskriptet och An Nguyen för att hjälpa till att optimera metoder för spridning och färgning kromosomer från zebrafisk meiocyter. Detta arbete stöddes av NIH R01 GM079115 som tilldelats S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
