Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten
Summary
Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.
Abstract
Meiose ist der wichtigste zelluläre Prozess erforderlich, um haploide Gameten für die sexuelle Reproduktion zu erstellen. Modellorganismen haben entscheidend dazu beigetragen, die Chromosomenereignisse zu verstehen, die während der meiotischen Prophase stattfinden, einschließlich der Paarungs-, Synapsen- und Rekombinationsereignisse, die eine korrekte Chromosomensegregation gewährleisten. Während die Maus ein wichtiges Modell für das Verständnis der molekularen Mechanismen war, die diesen Prozessen zugrunde liegen, sind nicht alle meiotischen Ereignisse in diesem System analog zur menschlichen Meiose. Kürzlich haben wir das spannende Potenzial des Zebrafisches als Modell der menschlichen Spermatogenese demonstriert. Hier beschreiben wir detailliert unsere Methoden zur Visualisierung meiotischer Chromosomen und zugehöriger Proteine in Chromosomenausbreitungspräparaten. Diese Präparate haben den Vorteil, dass eine hochauflösende Analyse von Chromosomenstrukturen möglich ist. Zunächst beschreiben wir das Verfahren zur Zersebung von Hoden von erwachsenen Zebrafischen, gefolgt von Zelldissoziation, Lyse und Verbreitung der Chromosomen. Als Nächstes beschreiben wir das Verfahren zum Nachweis der Lokalisation von meiotischen Chromosomenproteinen durch Immunfluoreszenznachweis und Nukleinsäuresequenzen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Diese Techniken umfassen eine nützliche Reihe von Werkzeugen für die zytologische Analyse der meiotischen Chromatin-Architektur im Zebrafischsystem. Forscher in der Zebrafischgemeinschaft sollten in der Lage sein, diese Techniken schnell zu beherrschen und in ihre Standardanalysen der Fortpflanzungsfunktion zu integrieren.
Introduction
Die sexuelle Fortpflanzung erfolgt durch die Kombination zweier haploider Gameten, die jeweils die Hälfte des Chromosoms einer somatischen Zelle tragen. Meiose ist eine spezialisierte Zellteilung, die haploide Gameten durch eine Runde DNA-Replikation und zwei aufeinander folgende Runden der Chromosomensegregation produziert. In proPhase I müssen homologe Chromosomen (Homologe) paarwerden, rekombinieren und synapsisieren, wobei letztere durch die Bildung des synaptonemalen Komplexes gekennzeichnet ist, der zwei Homologachsen umfasst, die durch das Querfilament, Sycp1 (Abbildung 1A,B) überbrückt werden. Wenn diese Prozesse nicht ordnungsgemäß ausgeführt werden, kann dies zur Produktion von aneuploiden Gameten führen, die eine der Hauptursachen für Fehlgeburten beim Menschen sind1. Unser Wissen über die Koordination zwischen Paarung, Rekombination und Synapse wurde durch Studien in einer Vielzahl von Organismen, wie Hefe, C. elegans,Maus und Drosophila,unter anderem2erleichtert. Während der allgemeine Prozess der homologen Chromosomenpaarung, gefolgt von Segregation, gut konserviert ist, variiert seine Abhängigkeit von Rekombination und Synapse und die Reihenfolge dieser Ereignisse.
Meiotische Doppelstrangbruchbildung (DSB), die eine homologe Rekombination initiiert, tritt in der Nähe von Telomere auf, die während Leptotene im Bouquet gebündelt sind, und Synapse folgt kurz nach3,4. Diese Konfiguration der DSB-Bildung und Synapsis-Initiation ist auch ein Merkmal der männlichen Meiose beim Menschen, aber nicht in Maus5,6,7,8, was darauf hindeutet, dass Zebrafische als Modell für die menschliche Spermatogenese dienen können. Es gibt auch mehrere praktische Vorteile des Studiums Zebrafisch Meiose. Sowohl Männchen als auch Weibchen durchlaufen Gametogenese während des gesamten Erwachsenenalters, ihre Gonaden sind leicht zugänglich, und Hunderte von Nachkommen werden aus einem einzigen Kreuz erzeugt. Darüber hinaus sind die Embryonen transparent und entwickeln sich extern, was die Früherkennung von Aberrationen in der embryonalen Entwicklung durch aneuploide Gameten3,9erleichtert. Nachteile der Verwendung von Zebrafischen sind, dass sie langsam die Geschlechtsreife erreichen (ca. 60 Tage) und die Menge an Material, das für nukleare Oberflächenausbreitungen benötigt wird, muss von 10-20 erwachsenen Tieren gesammelt werden, abhängig von ihrer Größe.
Meiotische Chromosomenausbreitungspräparate sind ein wichtiges Werkzeug, um die Chromosomendynamik über alle Modellorganismen hinweg zu untersuchen, da Schlüsselsignaturen der meiotischen Chromosomendynamik untersucht werden können. Bei Zebrafischen wurden Schlüsselaspekte des Fortschreitens des meiotischen Programms und der nuklearen Organisation durch die Sondierung von nuklearen Oberflächenausbreitungen, hier als Chromosomausbreitung bezeichnet, mit Antikörpern zum Immunfluoreszenznachweis von Proteinen und/oder Nukleinsäuren durch FISH3,4,9,10,11,12seziert. Tatsächlich kann die polarisierte Lokalisierung von gruppierten Telomere im Bouquet in der Ausbreitungszubereitung erhalten bleiben (Abbildung 1C). Kürzlich haben wir Zebrafisch-Spermatozyten-Chromosom-Spreads zusammen mit Fluoreszenz-Detektionsmethoden und superhochauflösender Mikroskopie verwendet, um das detaillierte Fortschreiten der Zebrafisch-Telomer-Dynamik, homologen Chromosomenpaarung, Doppelstrang-Break-Lokalisierung und Synapsen an wichtigen meiotischen Übergängen3zu klären. Hier stellen wir Methoden zur Vorbereitung von Chromosomenausbreitungen aus Spermatozyten der Zebrafischhoden vor und färben sie anschließend mit fluoreszierenden Peptidnukleinsäure-Sonden (PNA) zu wiederholten Telomersequenzen und Immunfluoreszenznachweis von Chromosomen-assoziierten Proteinen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir Methoden zur Untersuchung der Lage von Telomeren und chromosomassoziierten Proteinen in nuklearen Oberflächenausbreitungen aus Spermatozyten, die aus Zebrafischhoden isoliert sind. Wir erwarten, dass diese Methoden für die Analyse von Spermatozyten in anderen Teleostarten mit Anpassung an die Größe der Hoden anwendbar sein werden.
Während nur wenige Antikörper zu meiotischen Proteinen von Zebrafischen erhoben wurden, hatten wir Erfolg mit den folgenden Antikörpern, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Trent Newman und Masuda Sharifi für ihre Kommentare zum Manuskript und An Nguyen für ihre Hilfe bei der Optimierung von Methoden zur Verbreitung und Färbung von Chromosomen aus Zebrafisch-Meiocyten. Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM079115 an S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
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