Isolamento concomitante de astrócitos primários e microglia para infecção por parasitas protozoários
Summary
O objetivo geral deste protocolo é instruir como extrair, manter e dissociar as células murina e microglia do sistema nervoso central, seguidas de infecção com parasitas protozoários.
Abstract
Astrócitos e microglia são as células gliais mais abundantes. São responsáveis pelo apoio fisiológico e manutenção da homeostase no sistema nervoso central (SNC). As evidências crescentes de seu envolvimento no controle de doenças infecciosas justificam o interesse emergente no aprimoramento de metodologias para isolar astrócitos primários e microglia, a fim de avaliar suas respostas às infecções que afetam o SNC. Considerando o impacto da infecção por Trypanosoma cruzi (T. cruzi)e Toxoplasma gondii (T. gondii)no CNS, aqui fornecemos um método para extrair, manter, dissociar e infectar astrócitos de murina e células de microglia com parasitas protozoários. As células extraídas de cortices recém-nascidos são mantidas in vitro por 14 dias com substituição periódica diferencial da mídia. Astrócitos e microglias são obtidos a partir do mesmo protocolo de extração por dissociação mecânica. Após a fenotipagem por citometria de fluxo, as células são infectadas com protozoários parasitas. A taxa de infecção é determinada por microscopia de fluorescência em diferentes pontos de tempo, permitindo assim a avaliação da capacidade diferencial das células gliais para controlar a invasão e a replicação do protozoário. Essas técnicas representam métodos simples, baratos e eficientes para estudar as respostas dos astrócitos e microglia às infecções, abrindo o campo para análises neuroimunologia suplementares.
Introduction
O SNC é composto principalmente por neurônios e células gliais1,2,3. Microglia e astrócitos são as células glia mais abundantes no SNC. Microglia, o macrófago residente, é a célula de glia imunocompetente e fagocítica no CNS3,4, enquanto os astrócitos são responsáveis pela manutenção da homeostase e exercem funções de apoio5.
Apesar de as células gliais serem conhecidas por serem conhecidas por serem responsáveis pelo apoio e proteção dos neurônios6,7, funções emergentes dessas células foram descritas na literatura recente, incluindo suas respostas às infecções8,9,10,11. Assim, há um empurrão para desenvolver métodos para isolar essas células gliais para entender suas funções individualmente.
Existem alguns modelos alternativos para estudar células gliais em vez de culturas primárias, como linhagens celulares imortalizadas e modelos in vivo. No entanto, as células imortalizadas são mais propensas a sofrer deriva genética e alterações morfológicas, enquanto estudos in vivo impõem condições limitadas de manipulação. Por outro lado, as culturas primárias são fáceis de manusear, se assemelham melhor às células in vivo e também nos permitem controlar fatores experimentais12,13. Aqui, descrevemos orientações sobre como extrair, manter e dissociar os astrócitos murina e as células primárias de microglia no mesmo protocolo. Além disso, também fornecemos exemplos de como trabalhar com a infecção por protozoários nessas culturas.
As células CNS extraídas de camundongos neonatais (até 3 dias de idade) foram cultivadas durante 14 dias em meios diferenciais que permitem o crescimento preferencial de astrócitos e microglias. Uma vez que a microglia está acima dos astrócitos anexados, as populações celulares foram mecanicamente dissociadas em uma incubadora orbital. Em seguida, coletamos todo o sobrenadante contendo microglia e adicionamos tripsina para desapegar os astrócitos. As células gliais isoladas foram avaliadas fenotipicamente por citometria de fluxo e banhadas de acordo com o experimento desejado.
Também fornecemos exemplos de como infectar essas microglias isoladas e astrócitos com parasitas protozoários. T. gondii é um protozoário altamente neurotrópico responsável pela toxoplasmose14, enquanto T. cruzi é responsável pela doença de Chagas que pode levar ao desenvolvimento de distúrbios neurológicos na CNS15,16. Além disso, também foi relatado que a infecção por T. gondii17,18 ou T. cruzi19,20,21 foram a causa presumida de morte em pacientes imunocomprometidos. Portanto, a elucidação do papel imunológico das células gliais do SNC no controle das infecções por protozoários é de grande importância.
Protocol
Representative Results
Discussion
A importância de estudar funções isoladas de células gliais em contextos biológicos distintos vem se expandindo nas últimas duas décadas. Compreender o SNC além dos neurônios ainda é um campo crescente na biologia celular, especialmente infecções ou condições inflamatórias8,9,24. As células gliais são cruciais não apenas para o suporte físico dos neurônios (como era conhecido anteriormente), mas também em mu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao professor Dr. Renato A. Mortara, da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), pelo mAb 2C2 anti-Ssp-4. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, na justiça, na obra). subvenção 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código financeiro 001). M.P.A. recebe bolsa do CNPq, A.L.O.P. recebe bolsa da CAPES, e I.S.F e L.Z.M.F.B. recebem bolsa da FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
References
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