Gleichzeitige Isolierung von Primärastrozyten und Mikroglia bei Protozoenparasiten-Infektion
Summary
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu unterweisen, wie man murine Astrozyten- und Mikrogliazellen aus dem zentralen Nervensystem extrahiert, aufrechterhält und dissoziiert, gefolgt von einer Infektion mit Protozoenparasiten.
Abstract
Astrozyten und Mikroglia sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen. Sie sind verantwortlich für physiologische Unterstützung und Homöostase-Wartung im Zentralnervensystem (ZNS). Die zunehmenden Beweise für ihre Beteiligung an der Bekämpfung von Infektionskrankheiten rechtfertigen das sich abzeichnende Interesse an der Verbesserung der Methoden zur Isolierung primärer Astrozyten und Mikroglia, um ihre Reaktionen auf Infektionen, die das ZNS betreffen, zu bewerten. Unter Berücksichtigung der Auswirkungen der Trypanosoma cruzi (T. cruzi) und Toxoplasma gondii (T. gondii) Infektion im ZNS, hier bieten wir eine Methode, um zu extrahieren, zu pflegen, zu dissoziieren und murine Astrozyten und Mikrogliazellen mit ProtozoenParasiten zu infizieren. Extrahierte Zellen aus neugeborenen Kortiken werden 14 Tage lang in vitro mit periodischem Differentialmedienersatz gehalten. Astrozyten und Mikroglia werden aus dem gleichen Extraktionsprotokoll durch mechanische Dissoziation gewonnen. Nach der Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie werden Zellen mit Protozoenparasiten infiziert. Die Infektionsrate wird durch Fluoreszenzmikroskopie zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt, wodurch die Differenzfähigkeit von Gliazellen zur Kontrolle der protozoischen Invasion und Replikation bewertet wird. Diese Techniken stellen einfache, kostengünstige und effiziente Methoden dar, um die Reaktionen von Astrozyten und Mikroglia auf Infektionen zu untersuchen und das Feld für weitere neuroimmunologische Analysen zu öffnen.
Introduction
Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen und Gliazellen1,2,3. Mikroglia und Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im ZNS. Microglia, das ansässige Makrophagen, ist die immunkompetente und phagozytische Gliazelle im ZNS3,4, während Astrozyten für die Aufrechterhaltung der Homöostase verantwortlich sind und unterstützende Funktionen ausüben5.
Obwohl Gliazellen klassisch bekannt sind, verantwortlich für die Unterstützung und den Schutz der Neuronen6,7, neu entstehende Funktionen dieser Zellen wurden in der jüngsten Literatur beschrieben, einschließlich ihrer Reaktionen auf Infektionen8,9,10,11. Daher gibt es einen Vorstoß, Methoden zu entwickeln, um diese Gliazellen zu isolieren, um ihre Funktionen individuell zu verstehen.
Es gibt einige alternative Modelle, um Gliazellen zu untersuchen, anstatt Primärkulturen, wie verewigte Zelllinien und In-vivo-Modelle. Verewigte Zellen unterliegen jedoch eher genetischen Driften und morphologischen Veränderungen, während In-vivo-Studien begrenzte Manipulationsbedingungen auferlegen. Umgekehrt sind Primärkulturen einfach zu handhaben, ähneln besser in vivo Zellen und ermöglichen es uns auch, experimentelle Faktoren zu kontrollieren12,13. Hier beschreiben wir Richtlinien, wie man murine Astrozyten und Mikroglia-Primärzellen im selben Protokoll extrahiert, pflegt und dissoziiert. Darüber hinaus bieten wir auch Beispiele, wie mit Protozoeninfektionen in diesen Kulturen zu arbeiten.
ZNS-Zellen, die aus neonatalen Mäusen (bis zu 3 Tage alt) extrahiert wurden, wurden 14 Tage lang auf differentialen Medien kultiviert, die das bevorzugte Wachstum von Astrozyten und Mikrogliazellen ermöglichen. Da Mikroglia über den angeschlossenen Astrozyten ruht, wurden Zellpopulationen in einem Orbital-Inkubator mechanisch dissoziiert. Als nächstes sammelten wir alle Überstande, die Mikroglia enthielten, und fügten Trypsin hinzu, um Astrozyten zu lösen. Isolierte Gliazellen wurden phänotypisch durch Durchflusszytometrie ausgewertet und nach dem gewünschten Experiment plattiert.
Wir lieferten auch Beispiele, wie man diese isolierten Mikroglia und Astrozyten mit Protozoenparasiten infiziert. T. gondii ist ein hochneurotroper Protozoen, der für Toxoplasmose14verantwortlich ist, während T. cruzi für die Chagas-Krankheit verantwortlich ist, die zur Entwicklung neurologischer Störungen im ZNS15,16führen kann. Darüber hinaus wurde auch berichtet, dass eine Infektion mit T. gondii17,18 oder T. cruzi19,20,21 die mutmaßliche Todesursache bei immungeschwächten Patienten waren. Daher ist die Aufklärung der immunologischen Rolle von Gliazellen aus dem ZNS bei der Kontrolle von Protozoeninfektionen von großer Bedeutung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bedeutung der Untersuchung isolierter Gliazellen in unterschiedlichen biologischen Kontexten hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten ausgeweitet. Das Verständnis des ZNS über Neuronen hinaus ist immer noch ein wachsendes Feld in der Zellbiologie, vor allem bei Infektionen oder entzündlichen Erkrankungen8,9,24. Gliazellen sind nicht nur für die körperliche Unterstützung der Neuronen (wie es früher bekannt war), sonder…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Professor Dr. Renato A. Mortara von der Föderalen Universität von Sao Paulo (UNIFESP) für mAb 2C2 anti-Ssp-4. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Fundao de Amparo , Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, Stipendium 2017/25942-0 an K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientéfico e Tecnolégico (CNPq, 402100/2016-6 an K.R.B.), das Instituto Nacional de Ciéncia e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) und Coordenaéo de Aperfeiéoamento de Pessoal de Nével Superior (CAPES, Finanzkodex 001). M.P.A. erhält ein Stipendium von CNPq, A.L.O.P. erhält ein Stipendium von CAPES und I.S.F und L.Z.M.F.B. ein Stipendium von FAPESP.
Materials
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 mm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat – anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS – Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10X) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60×15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 ºC with trypsin |
References
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