JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

神経紋の分離、培養、脂肪形成誘導、周食脂肪組織由来の脂肪由来幹細胞

Published: March 02, 2020
doi:
10.3791/60691
, , , , , , , ,
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital,Shanghai Jiao Tong University, 2Shanghai Institute of Nutrition and Health, Shanghai Institute for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences, 3Shanghai Key Laboratory of Hypertension, Shanghai Institute of Hypertension,Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Department of Cardiology, Shanghai General Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Department of Cardiology, Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine,Huadong Hospital Affiliated to Fudan University

Summary

Wnt-1 Cre+/-の周産脂肪組織から誘導された脂肪由来幹細胞 (NCAC) の神経堤の分離、培養、脂肪誘導のプロトコルを提示します。ローザ26RFP/+マウス。NCAdscは、インビトロで脂肪形成または脂肪形成をモデル化するためのACの簡単にアクセス可能なソースであることができます。

Abstract

血管を取り巻く脂肪組織の過剰な量(PVATとも呼ばれる血管周囲脂肪組織)は、心血管疾患のリスクが高いと関連している。異なる脂肪組織に由来するAVCは明確な特徴を示し、PVATからのAPCは十分に特徴付けされていなかった。最近の研究では、周皮弓脂肪組織(PAAT)の一部のADCが、外虫に由来する一過性の移動細胞である神経堤細胞(NCCs)から下降することを報告した。

本稿では、Wnt-1 Cre+/-のPAATから赤蛍光タンパク質(RFP)標識NCCを分離するためのプロトコルについて説明する。Rosa26RFP/+マウスと体外でのそれらの二分化を誘導します。簡単に言うと、間質血管画分(SVF)はPAATから酵素的に解離され、RFP+神経堤由来AVC(NCADSC)は蛍光活性化細胞選別(FACS)によって単離される。NCADSCは、茶色と白の両方のアディポサイトに分化し、凍結保存することができ、〜3〜5節の間、その有数可能性を保持することができます。当社のプロトコルは、PVATの脂肪形成またはインビトロでの脂肪生成のモデル化のためにPVATから豊富なAdscを生成することができる。したがって、これらのNCADSCはPVAT分化に関与する分子スイッチを研究するための貴重なシステムを提供することができる。

Introduction

肥満の罹患率は世界的に増加しており、これは心血管疾患および糖尿病を含む関連慢性疾患のリスクを増大させる1.PVATは血管を取り囲み、血管系機能に関与する内分泌およびパラクリン因子の主要な供給源である。臨床研究は、高いPVAT含有量が心血管疾患2、3の独立した危険因子であり、その病理学的機能が構成脂肪由来幹細胞(AC)の表現型に依存することを示す4。

マウス3T3-L1、3T3-F442A、OP9などのADSC細胞株は、脂肪形成または脂肪形成5を研究するのに有用な細胞モデルであるが、脂肪形成のための調節機構は細胞株と一次細胞間で異なる。間質血管細胞画分(SVF)中のAVCは脂肪組織から直接分離し、生体内脂肪形成および脂肪形成6で再キャピテーションする可能性が最も高い脂肪細胞に分化するように誘導される。しかし、APCの脆弱性、浮力、およびサイズと免疫フェノタイプのバリエーションは、その直接的な分離を困難にします。さらに、異なる分離手順は、これらの細胞7の表現型および食前性電位能力にも大きな影響を及ぼし、したがってADSC完全性を維持するプロトコルの必要性を強調する。

脂肪組織は典型的には、形態学的および機能的に別個の白色脂肪組織(WAT)、または褐色脂肪組織(BAT)8のいずれかに分類され、これらは異なるACC9を収容する。皮下過性およびインギナル皮下WATから単離されたAVCは、以前の研究9、10、11、12で特徴付けられてきたが、BAT13を主成分とするPVATからのAVCに関してはあまり知られていない。

最近の研究では、周皮弓脂肪組織(PAAT)に存在するADCの一部が神経堤細胞(NCCs)に由来することを発見した。Wnt1-Creトランスジェニックマウスは、神経堤細胞発生16、17をトレースするために使用した。私たちは、Wnt-1 Cre+/-を生成する Rosa26RFP/+マウスと Wnt1-Cre+マウスを交配しました。Rosa26RFP/+マウスは、NCCとその子孫が赤色蛍光タンパク質(RFP)で標識され、生体内およびインビトロ15で容易に追跡される。ここでは、マウスPAATから神経堤由来AVC(NC由来AVC、またはNCAC)を分離し、白色のアディポサイトまたは褐色のアディポサイトに分化するようにNCAdsCを誘導する方法について説明する。

Protocol

動物のプロトコルは、上海交通大学の動物ケア委員会によって審査され、承認されています. 1. Wnt-1 Cre+/-の生成;ローザ26RFP/+マウス クロスWnt-1 Cre+/-マウス16 Rosa26RFP/+マウス18を用いて Wnt-1 Cre+/-を生成する ;ローザ26RFP/+マウス。生後4~8週間まで、病原体のない施設で12時間の明暗サ?…

Representative Results

上記のプロトコルを使用して、5–6 Wnt-1 Cre+/-から~0.5~1.0 x 106 Adscを取得しました。Rosa26RFP/+マウス (48 週齢, 男性または女性). マウスからのPAATの収集のフローチャートを図1に示します。NCAdsCsの形態は、他のマウス脂肪組織からのADSCに類似していた。培養されたNcAdscは、7-8日の培養後に80~90%の合流率に達し、NCAdsCは線維芽細胞?…

Discussion

本研究では、Wnt-1 Cre+/-のPVATから抽出されたNCACの分離、培養、および食化誘導のための信頼できる方法を提示する。RFP+ ADCを製造するように設計されたRosa26RFP/+トランスジェニックマウス。これまでの報告では、NCACおよび非NCAdsC2における一般的な多能性間葉系幹細胞(CS)マーカーの発現に有意差はなく、NCAdsCはビトロ15,22,23の中でジポサイトに分化す?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

中国国家主要研究開発プログラム(2018YFC1312504)、中国自然科学財団(81970378、81670360、81870293)、上海市科学技術委員会(174119710000、17140902402)が提供した。.

Materials

4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
  2. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  3. Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
  4. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  5. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  6. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  7. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  8. Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
  9. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  10. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  11. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  12. Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
  13. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  14. Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
  15. Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
  16. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
  17. Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
  18. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  19. Tan, P., Pepin, &. #. 2. 0. 1. ;., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
  20. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  21. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  22. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
  23. Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  24. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).

Tags

Neural CrestAdipose-derived Stem CellsPVAT AdipogenesisADSCSNCADSCSFACSMagnetic Activated Cell Sorting3T3 CellsAdipogenesisLipogenesisPAAT Dissection
check_url/60691?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image