Isolamento, cultura e induzione adipogenica di cellule staminali adipose originali adipose-derivate da cellule staminali periaortiche
Summary
Vi presentiamo un protocollo per l’isolamento, la coltura e l’induzione adipogenica delle cellule staminali derivate dalla cresta neurale derivate da cellule staminali derivate da adiposo (NCADSC) dal tessuto adiposo periaortico del Wnt-1Cre Topi Rosa26RFP/z. Le NCADSC possono essere una fonte facilmente accessibile di ADSC per la modellazione dell’adipogenesi o della lipogenesi in vitro.
Abstract
Una quantità eccessiva di tessuto adiposo che circonda i vasi sanguigni (tessuto adiposo perivascolare, noto anche come PVAT) è associato ad un alto rischio di malattie cardiovascolari. Gli ADSC derivati da diversi tessuti adiposi mostrano caratteristiche distinte, e quelli del PVAT non sono stati ben caratterizzati. In un recente studio, abbiamo riferito che alcuni ADSC nel tessuto adiposo arco periaortico (PAAT) discendono dalle cellule della cresta neurale (NCC), una popolazione transitoria di cellule migratorie provenienti dall’ectoderma.
In questo articolo, descriviamo un protocollo per l’isolamento delle cCI con etichettatura RFP (proteina fluorescente rossa) dal PAAT del Wnt-1Cre MiriRosa26 RFP/z e inducendo ne la differenziazione adipogenica in vitro. In breve, la frazione vascolare stromale (SVF) è enzimaticamente dissociata dal PAAT, e la RFP– ADSC derivato dalla cresta neurale (NCADSC) sono isolati dalla fluorescenza activated cell sorting (FACS). Le NCADSC si differenziano in adipociti sia marroni che bianchi, possono essere crioconservate e mantenere il loro potenziale adipogenico per passaggi da 3 a 5 dollari. Il nostro protocollo può generare ABbondanti ADSC dal PVAT per la modellazione dell’adipogenesi PVAT o della lipogenesi in vitro. Pertanto, queste NCADSC possono fornire un valido sistema per studiare gli interruttori molecolari coinvolti nella differenziazione PVAT.
Introduction
La prevalenza dell’obesità è in aumento in tutto il mondo, il che aumenta il rischio di malattie croniche correlate, tra cui malattie cardiovascolari e diabete1. IL PVAT circonda i vasi sanguigni ed è una delle principali fonti di fattori endocrini e paracrini coinvolti nella funzione di vascolatura. Studi clinici dimostrano che l’elevato contenuto di PVAT è un fattore di rischio indipendente della malattia cardiovascolare2,3, e la sua funzione patologica dipende dal fenotipo delle cellule staminali derivate da adiposa costitutive (ADSC)4.
Anche se le linee cellulari ADSC come il murino 3T3-L1, 3T3-F442A e OP9 sono utili modelli cellulari per studiare l’adipogenesi o la lipogenesi5, i meccanismi regolatori per l’adipogenesi differiscono tra le linee cellulari e le cellule primarie. Gli ADSC nella frazione di cellula vascolare stromale (SVF) isolati direttamente dai tessuti adiposi e indotti a differenziarsi in adipociti molto probabilmente ricapitolano in vivo adipogenesi e lipogenesi6. Tuttavia, la fragilità, la galleggiabilità e le variazioni di dimensioni e immunofenotipi degli ADSC rendono difficile il loro isolamento diretto. Inoltre, le diverse procedure di isolamento possono anche influenzare in modo significativo il fenotipo e la capacità potenziale adipogenica di queste cellule7, sottolineando così la necessità di un protocollo che mantenga l’integrità dell’ADSC.
Il tessuto adiposo è tipicamente classificato come il tessuto adiposo bianco (WAT) morfologicamente e funzionalmente distinto, o il tessuto adiposo marrone (BAT)8, che ospita ADSC distinti9. Mentre gli ADSC isolati dai WAT sottocutanei perigonadali e inguinali sono stati caratterizzati negli studi precedenti9,10,11,12, meno è noto per quanto riguarda gli ADSC da PVAT che è composto principalmente da BAT13.
In uno studio recente, abbiamo scoperto che una parte degli ADSC residenti nel tessuto adiposo dell’arco periaortico (PAAT) è derivata da cellule della cresta neurale (NCC), una popolazione transitoria di cellule progenitrici migratorie che provengono dall’ectoderma14,15. I topi transgenici Wnt1-Cre sono stati utilizzati per tracciare lo sviluppo delle cellule della cresta neurale16,17. Abbiamo attraversatoi topi Wnt1-Cre con i topi Rosa26RFP/ s per generare Wnt-1Cre. I topi Rosa26RFP/z, in cui gli NCC e i loro discendenti sono etichettati con proteine fluorescenti rosse (RFP) e sono facilmente rintracciabili in vivo e in vitro15. In questo articolo viene descritto un metodo per isolare gli ADSC derivati dalla cresta neurale (ADSC derivati da NC o NCADSC) dal PAAT del topo e induriamo gli NCADSC a differenziarsi in adipociti bianchi o adipociti bruni.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, presentiamo un metodo affidabile per l’isolamento, la cultura e l’induzione adipogenica degli NCADSC estratti dal PVAT di Wnt-1 Cre. Topi transgenici Rosa26RFP/z progettati per la produzione di RFPe ADSC. Le relazioni precedenti mostrano che non vi è alcuna differenza significativa nell’espressione dei marcatori di cellule staminali mesenchymale (MSC) multipotenti in NCADSC e non NCADSC22e che gli NCADSC hanno un forte potenziale per differenziar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), e la Commissione scienza e tecnologia del comune di Shanghai (174111971000, 17140902402) ha fornito i fondi per questo studio .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
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