पेरियाऑर्टिक एडीपोज ऊतक से न्यूरल क्रेस्ट मूल आदिपोज-व्युत्पन्न स्टेम सेल का अलगाव, संस्कृति और एडिपोजेनिक प्रेरण
Summary
हम एनडब्ल्यूटी-1 क्रे+/-के पेरियाऑर्टिक एडीपोज ऊतक से न्यूरल क्रेस्ट व्युत्पन्न स्टेम सेल (एनसीएडीएससी) के अलगाव, संस्कृति और आदिपोजेनिक प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं; Rosa26RFP/+ चूहों । एनसीएडीसीएस विट्रो में एडिपोजेनेसिस या लिपोजेनेसिस मॉडलिंग के लिए एडीएससी का आसानी से सुलभ स्रोत हो सकता है।
Abstract
रक्त वाहिकाओं के आसपास के एडीपोस ऊतक की अत्यधिक मात्रा (पेरिवस्कुलर एडीपोज ऊतक, जिसे पीवीएटी भी कहा जाता है) हृदय रोग के उच्च जोखिम से जुड़ा हुआ है। विभिन्न एडीपोज़ ऊतकों से प्राप्त एडीएससी अलग-अलग विशेषताएं दिखाते हैं, और पीवीएटी के लोगों को अच्छी तरह से चित्रित नहीं किया गया है। हाल ही में एक अध्ययन में, हमने बताया कि पेरियाऑर्टिक आर्क एडीपोज ऊतक (PAAT) में कुछ एडीएससी तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं (एनसीसी) से उतरते हैं, जो एक्टोडर्म से उत्पन्न प्रवासी कोशिकाओं की क्षणिक आबादी है।
इस पेपर में, हम लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) को अलग-थलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं- डब्ल्यूएनटी-1 क्रे+/-के सैट से एनसीसी लेबल; Rosa26RFP/+ चूहों और विट्रो में उनके आदिपोजेनिक भेदभाव उत्प्रेरण । संक्षेप में, स्ट्रोमल वैस्कुलर अंश (एसवीएफ) को पीएटी से एंजाइमेट रूप से अलग किया जाता है, और आरएफपी+ तंत्रिका क्रेस्ट व्युत्पन्न एडीएससी (एनसीएडीसी) फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (एफएसीएस) द्वारा अलग-थलग कर दिया जाता है। एनसीएडीसीएस भूरे और सफेद आदिपोसाइट्स दोनों में अंतर करते हैं, क्रायोपआरक्षित हो सकते हैं, और ~ 3-5 मार्ग के लिए अपनी आदिगतिजनक क्षमता को बनाए रखते हैं। हमारा प्रोटोकॉल वीट्रो में पीवीएटी एडिपोजेनेसिस या लिपोजेनेसिस मॉडलिंग के लिए पीवीएटी से प्रचुर मात्रा में एडीएससी उत्पन्न कर सकता है। इस प्रकार, ये एनसीएडीसीएस पीवीएटी विभेदन में शामिल आणविक स्विच ों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
मोटापे की व्यापकता दुनिया भर में बढ़ रही है, जो हृदय रोग और मधुमेहसहितसंबंधित पुरानी बीमारियों का खतरा बढ़ जाती है 1 । PVAT रक्त वाहिकाओं के चारों ओर है और वैकुलचर समारोह में शामिल एंडोक्राइन और पैराक्रिन कारकों का एक प्रमुख स्रोत है। नैदानिक अध्ययनों से पता चलता है कि उच्च पीवीएटी सामग्री हृदय रोग2,3का एक स्वतंत्र जोखिम कारक है, और इसका पैथोलॉजिकल फ़ंक्शन घटक एडीपोज-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एडीएससी)4के फेनोटाइप पर निर्भर करता है।
हालांकि डाययूरिन 3T3-L1, 3T3-F442A, और OP9 जैसी एडीएससी सेल लाइनें एडीपोजेनेसिस या लिपोजेनेसिस5का अध्ययन करने के लिए उपयोगी सेलुलर मॉडल हैं, आदिपोजेनेसिस के लिए नियामक तंत्र सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के बीच भिन्न होते हैं। स्ट्रोमल वैस्कुलर सेल अंश (एसवीएफ) में एडीएससी सीधे एडीपोस ऊतकों से अलग हो गए और वीवो एडिपोजेनेसिस और लिपोजेनेसिस6में सबसे अधिक संभावना के पुनर्काटिलेट में अंतर करने के लिए प्रेरित किया। हालांकि, एडीएससी के आकार और इम्यूनोफेनोटाइप में कमजोरी, उछाल और भिन्नताएं उनके प्रत्यक्ष अलगाव को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। इसके अलावा, विभिन्न अलगाव प्रक्रियाएं इन कोशिकाओं7की फेनोटाइप और आदिगति संभावित क्षमता को भी काफी प्रभावित कर सकती हैं, इस प्रकार एडीएससी अखंडता को बनाए रखने वाले प्रोटोकॉल की आवश्यकता पर जोर दे सकती हैं।
एडीपोज ऊतक को आमतौर पर रूपात्मक रूप से और कार्यात्मक रूप से अलग सफेद एडीपोज ऊतक (वाट), या भूरे रंग के एडीपोज ऊतक (बैट)8के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जो अलग एएससी9को आश्रय देता है। जबकि पेरिगोननडाल और इंगिनल चमड़े के नीचे WATs से अलग एडीएससी पिछले अध्ययनों में विशेषता है9,10,11,12,कम PVAT से एडीएससी के बारे में जाना जाता है कि मुख्य रूप से BAT13से बना है ।
हाल ही में एक अध्ययन में, हमने पाया कि पेरिओरटिक आर्क एडीपोज ऊतक (PAAT) में निवासी एडीएससी का एक हिस्सा तंत्रिका शिखर कोशिकाओं (एनसीसी) से प्राप्त होता है, जो प्रवासी जनक कोशिकाओं की क्षणिक आबादी है जो एक्टोडर्म14,15से उत्पन्न होती है। WNt1-क्रे ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग तंत्रिका क्रेस्ट सेल विकास16,17का पता लगाने के लिए किया गया था। हमने Wnt-1 क्रे+/-उत्पन्न करने के लिए Rosa26RFP/+ चूहों के साथ Wnt1-Cre+ चूहों को पार कर लिया; Rosa26RFP/+ चूहों, जिसमें एनसीसी और उनके वंशजलाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के साथ लेबल कर रहे है और आसानी से वीवो में और इन विट्रो15ट्रैक कर रहे हैं । यहां, हम माउस PAAT से तंत्रिका क्रेस्ट व्युत्पन्न एडीएससी (नेकां-व्युत्पन्न एडीएससी, या एनसीएडीसी) को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और एनसीएडीडीसी को सफेद आदिपोसाइट्स या ब्राउन एडीपोसाइट्स में अंतर करने के लिए प्रेरित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम WNt-1 क्रे+/-के पीवीएटी से निकाले गए एनसीएडीडीसी के अलगाव, संस्कृति और आदिजनीय प्रेरण के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रस्तुत करते हैं; Rosa26RFP/+ ट्रांसजेनिक चूहों आरएफपी+ ADSCs का उत्पादन ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चीन का राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2018YFC1312504), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81970378, 81670360, 81870293), और शंघाई नगर पालिका के विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी आयोग (17411971000, 17140902402) ने इस अध्ययन के लिए धन प्रदान किया .
Materials
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
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