पूरी तरह से संसाधित पुनः संयोजन KRAS4b: फरनेसेटेड और मेथाइलेटेड प्रोटीन को अलग और विशेषता
Summary
प्रीनिलेशन परिधीय झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन पर एक महत्वपूर्ण संशोधन है। कीट कोशिकाओं को मात्रा में फर्नेसेटेड और कार्बोक्सिमेथाइलेटेड KRAS4b का उत्पादन करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है जो प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन के बायोफिजिकल माप को सक्षम करता है
Abstract
प्रोटीन प्रीनिलेशन एक महत्वपूर्ण संशोधन है जो इंट्रासेलर झिल्ली के लिए प्रोटीन को लक्षित करने के लिए जिम्मेदार है। KRAS4b, जो मानव कैंसर के 22% में उत्परिवर्तित है, सी-टर्मिनस में ‘सीएएएक्स’ बॉक्स आकृति की उपस्थिति के कारण फारनेसिलेशन और कार्बोक्सीमेथिलेशन द्वारा संसाधित किया जाता है। कीट कोशिकाओं में फर्नेसेटेड और कार्बोक्यामेथिलेटेड KRAS4b को व्यक्त करने के लिए एक इंजीनियर बैगोवायरस सिस्टम का उपयोग किया गया था और पहले वर्णित किया गया है। यहां, हम प्रोटीन के विस्तृत, व्यावहारिक शुद्धिकरण और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन का वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, एकरूपता के लिए प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आत्मीयता और आयन विनिमय क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया गया था। क्रास4बी के सही संशोधन को मान्य करने और न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को सत्यापित करने के लिए बरकरार और देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग किया गया था। अंत में, सतह प्लाज्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके फॉर्नेसिटेड और कार्बोक्सिमेथेलेटेड क्रास4बी के झिल्ली संघ को मापा गया।
Introduction
पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन प्रोटीन की कार्यात्मक गतिविधि को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। फॉस्फोरिलेशन और ग्लाइकोसिलेशन जैसे संशोधन अच्छी तरह से स्थापित हैं। लिपिड संशोधनों को कम अच्छी तरह से चित्रित किया जाता है, हालांकि। यह अनुमान लगाया गया है कि सभी सेलुलर प्रोटीन का 0.5% जितनाप्रीनिटेडहो सकता है । प्रीनिलेशन सीएएएक्स आकृति2युक्त एक स्वीकारकर्ता प्रोटीन के लिए 15-कार्बन फारनेसिल या 20-कार्बन गेरानिल्गेरानिल लिपिड श्रृंखला का हस्तांतरण है। प्रीनिटेड प्रोटीन को समय से पहले उम्र बढ़नेवाले 3, अल्जाइमर4,हृदय रोग5, कोरोइडेर्मिया6और कैंसर7सहित कई मानवीय रोगों की प्रगति में फंसाया गया है । छोटे GTPases, HRAS, NRAS, और KRAS1,परमाणु टुकड़े टुकड़े, और kinetochores CENP-ई और एफ बेसल हालत के तहत farnesylated प्रोटीन हैं । अन्य छोटे GTPases, अर्थात् RhoA, RhoC, Rac1, सीडीसी-४२, और RRAS geranylgeranylated8हैं, जबकि RhoB farnesylated या geranylgeranylated9किया जा सकता है ।
छोटे GTPase KRAS4b एक आणविक स्विच के रूप में कार्य करता है, अनिवार्य रूप से इंट्रासेलुलर सिग्नल ट्रांसडुक्शन रास्तों के लिए संकेत एक्स्ट्रासेलुलर विकास कारक संचारण जो कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के माध्यम से सेल विकास और प्रसार को प्रोत्साहित करते हैं। KRAS4b बायोकेमिस्ट्री के दो प्रमुख पहलू हैं जो इसकी गतिविधि के लिए आवश्यक हैं। सबसे पहले, एक निष्क्रिय सकल घरेलू उत्पाद और एक सक्रिय जीटीपी बाध्य राज्य के बीच प्रोटीन चक्र जिससे यह सक्रिय रूप से प्रभावकों के साथ संलग्न है । दूसरा, एक सी-टर्मिनल पॉली-लाइसिन क्षेत्र और एक फर्नेसेटेड और कार्बोक्सीमेथिलेटेड साइस्टीन प्रोटीन को प्लाज्मा झिल्ली पर निर्देशित करता है, जिससे डाउनस्ट्रीम प्रभावकों की भर्ती और सक्रियता सक्षम होती है। उत्परिवर्ती KRAS4b अग्नाशय, कोलोरेक्टल, और फेफड़ों के कैंसर10में एक कैंसरजनक चालक है, और इस तरह, चिकित्सीय हस्तक्षेप एक बड़ा नैदानिक लाभ होगा । प्रामाणिक रूप से संशोधित पुनः संयोजन प्रोटीन का उत्पादन जो फर्नेसेटेड और कार्बोक्सीमेथिलेटेड है, झिल्ली सरोगेट ्सजैसे लिपोसोम्स या लिपिड नैनोडिस्क11,12के संयोजन में KRAS4b का उपयोग करके जैव रासायनिक स्क्रीनिंग सक्षम करेगा ।
फारनेसिल ट्रांसफरेज (एफएनटी) KRAS4b में CAAX आकृति में सी-टर्मिनल साइस्टीन में फारनेसिल पायरोफॉस्फेट के अलावा उत्प्रेरक करता है। प्रीनिलेशन के बाद प्रोटीन की तस्करी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में की जाती है जहां रास परिवर्तित एंजाइम (आरसीई1) तीन सी-टर्मिनल अवशेषों को छोड़ देता है । प्रसंस्करण में अंतिम चरण ईआर झिल्ली प्रोटीन, आइसोफेनिलल मिथाइलट्रांसफरेसे (आईसीएमटी) द्वारा नए सी-टर्मिनल फारनेसिलासिस्टीन अवशेषों का मिथाइलेशन है। ई. कोलाई में पुनर्संयोजन KRAS4b की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप एक असंशोधित प्रोटीन का उत्पादन होता है। प्रसंस्कृत KRAS4b का उत्पादन करने के पिछले प्रयास संरचनात्मक या दवा स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए अपर्याप्त पैदावार के कारण सीमित किए गए हैं या देशी पूर्ण लंबाई परिपक्व प्रोटीन13,14को फिर से तैयार करने में विफल रहे हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक इंजीनियर baculovirus आधारित कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली और शुद्धि विधि है कि अत्यधिक शुद्ध, पूरी तरह से प्रसंस्कृत KRAS4b सेल संस्कृति के 5 मिलीग्राम/एल की पैदावार पर उत्पन्न करता है का उपयोग करता है ।
संरचनात्मक जीव विज्ञान या दवा स्क्रीनिंग अध्ययन पर तैयार करने से पहले पुनर्संयोजन प्रोटीन की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए सावधान प्रोटीन लक्षण वर्णन आवश्यक है। पूरी तरह से प्रसंस्कृत KRAS4b के दो प्रमुख मापदंडों सही prenyl संशोधन का सत्यापन और झिल्ली विकल्प या लिपिड के साथ बातचीत के लिए farnesylated और carboxymethylated सी-टर्मिनस (FMe) की उपलब्धता कर रहे हैं । KRAS4b-FMe के इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-एमएस) का उपयोग आणविक वजन को मापने और फारनेसिल और कार्बोक्सिमेथाइल संशोधनों की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए किया गया था। देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, जहां नमूनों को गैर-denaturing सॉल्वैंट्स के साथ छिड़काया जाता है, यह प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता था कि KRAS4b-FMe भी अपने सकल घरेलू उत्पाद कोफैक्टर से बंधा हुआ था। अंत में, सतह प्लाज्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग स्थिर लिपोसोम के साथ KRAS4b-FMe के प्रत्यक्ष बंधन को मापने के लिए किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया गया है, शुद्धिकरण के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम कम नमक में होने के समय के दौरान नमूने की हैंडलिंग है। समय है कि नमूना कम से कम २०० mM NaCl के संपर्क में है सीमित…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कैरिसा गरोज, जेन मेल्हालको और मैट आकर्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रयोगशाला, फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी फॉर कैंसर रिसर्च में क्लोनिंग और अभिव्यक्ति समर्थन स्वीकार करते हैं। इस परियोजना को अनुबंध संख्या के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से संघीय धन के साथ पूरे या भाग में वित्त पोषित किया गया है । HHSN261200800001E. इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचारों या स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग की नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और न ही व्यापार के नाम, वाणिज्यिक उत्पादों, या संगठनों का उल्लेख है अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
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