Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme
Summary
Prenilasyon periferik membran bağlayıcı proteinler üzerinde önemli bir değişikliktir. Böcek hücreleri, protein-protein ve protein-lipid etkileşimlerinin biyofiziksel ölçümlerini sağlayan miktarlarda farnesile tedavüle ve karboksimetilatlanmış KRAS4b üretmek için manipüle edilebilir.
Abstract
Protein prenilasyon hücre içi membranlara proteinleri hedeflemekten sorumlu önemli bir değişikliktir. İnsan kanserlerinin %22’sinde mutasyona uğrayan KRAS4b, C-terminusta ‘CAAX’ kutu motifinin varlığı nedeniyle farnesilasyon ve karboksimetilasyon ile işlenir. Böcek hücrelerinde farnesile ve karboksimetillenmiş KRAS4b’yi ifade etmek için tasarlanmış bir baculovirus sistemi kullanılmıştır ve daha önce tanımlanmıştır. Burada proteinin detaylı, pratik saflaştırma ve biyokimyasal karakterizasyonu anlatılır. Özellikle proteini homojenliğe çıkarmak için yakınlık ve iyon değişimi kromatografisi kullanılmıştır. KRAS4b’nin doğru modifikasyonunun doğrulanması ve nükleotit bağlanmasının doğrulanması için sağlam ve yerli kütle spektrometresi kullanılmıştır. Son olarak, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi ile farneslü ve karboksimetillenmiş KRAS4b’in membran ilişkisi ölçüldü.
Introduction
Posttranslational değişiklikler proteinlerin fonksiyonel aktivitesinin tanımlanmasında önemli bir rol oynamaktadır. Fosforilasyon ve glikozilasyon gibi modifikasyonlar iyi belirlenmiştir. Lipid modifikasyonları daha az iyi karakterize, ancak. Tüm hücresel proteinlerin %0.5’inin prenylatedolabileceğitahmin edilmektedir. Prenilasyon 15 karbonlu farnesil veya 20 karbonlu geranylgeranyl lipid zincirinin CAAXmotifi 2içeren bir kabul proteinine aktarılmasıdır. Prenylated proteinler erken yaşlanma da dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarının ilerlemesi karıştığı olmuştur3, Alzheimer4, kardiyak disfonksiyon5, koreideremia6, ve kanser7. Küçük GTPases, HRAS, NRAS, ve KRAS1, nükleer lamininler, ve kinetochores CENP-E ve F bazal durum altında farneslü proteinlerdir. Diğer küçük GTPases, yani RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, ve RRAS geranylgeranylated8, RhoB farneslü veya geranylgeranylated olabilir ise9.
Küçük GTPase KRAS4b moleküler bir anahtar olarak işlev görür, aslında hücre içi sinyal iletim yolları sinyal yoluyla hücre içi sinyal iletim yolları, birden fazla protein-protein etkileşimleri yoluyla. KRAS4b biyokimyasının aktivitesi için gerekli olan iki temel yönü vardır. İlk olarak, protein aktif olmayan bir GSYİh ile aktif GTP bağlı durum arasında döngüler ve bu da aktif olarak efektörlerle etkileşime girer. İkinci olarak, Bir C-terminal poli-lizin bölgesi ve farnesile ve karboksimetilile sistein plazma membran protein doğrudan, işe alma ve downstream efektörleri aktivasyonu sağlayan. Mutant KRAS4b pankreas bir onkojenik sürücü, kolorektal, ve akciğer kanseri10, ve gibi, terapötik müdahale büyük bir klinik yararı olurdu. Farnesile ve karboksimetilated otantik modifiye rekombinant protein üretimi lipozomlar veya lipid nanodiskler 11 gibi membran suretleri ile birlikte KRAS4b kullanarak biyokimyasal tarama sağlayacak11,12.
Farnesyl transferaz (FNT), KRAS4b’deki CAAX motifinde farnesil pirofosfat ın C-terminal sisteinına eklenmesini katalizler. Prenilasyondan sonra protein endoplazmik retikuluma (ER) kaçırılır ve Ras dönüştürücü enzim (RCE1) üç C-terminal kalıntısını bırakır. İşleme de son adım ER membran proteini, isoprenylsistein karboksil metiltransferaz (ICMT) tarafından yeni C-terminal farnesylsistein kalıntısı metilasyon olduğunu. E. coli rekombinant KRAS4b ifadesi değiştirilmemiş bir protein üretimi ile sonuçlanır. İşlenmiş KRAS4b üretmek için önceki girişimleri yapısal veya ilaç tarama deneyleri için yetersiz verim nedeniyle sınırlı olmuştur ya da yerli tam uzunlukta olgun protein13,14recapitulate başarısız oldu. Burada sunulan protokol, hücre kültürünün 5 mg/L verimlerinde yüksek oranda saflaştırılmış, tam olarak işlenmiş KRAS4b üreten, tasarlanmış bakülovirüs tabanlı böcek hücresi ekspresyonu sistemi ve arınma yöntemini kullanmaktadır.
Yapısal biyoloji veya ilaç tarama çalışmalarına başlamadan önce rekombinant proteinlerin kalitesini doğrulamak için dikkatli protein karakterizasyonu gereklidir. Tam olarak işlenmiş KRAS4b’in iki temel parametresi doğru prenyl modifikasyonunun doğrulanması ve farnesile ve karboksimetilileli C terminusun (FMe) membran ikameleri veya lipidleri ile etkileşim için kullanılabilirliğidir. KraS4b-FMe elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) moleküler ağırlığı ölçmek ve farnesyl ve karboksimetil modifikasyonları varlığını doğrulamak için kullanılmıştır. Numunelerin nondenaturing çözücülerle püskürtüldüğü yerli kütle spektrometresi, KRAS4b-FMe’nin de GSYİh kofaktöre bağlı olduğunu göstermek için kullanıldı. Son olarak, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi immobilize lipozomlar ile KRAS4b-FMe doğrudan bağlanmasını ölçmek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Temsilci Sonuçları bölümünde belirtildiği gibi, arınma sırasında ki en kritik adım, numunenin daha düşük tuzda olduğu süre boyunca işlenmesidir. Numunenin 200 mM’den daha az NaCl’ye maruz kalma süresini sınırlamak yağışı azaltmaya ve numune verimini artırmaya yardımcı olacaktır. Profil beklentilerle uyuşmuyorsa CEX sonuçlarının yorumlanması zor olabilir (bkz. Şekil 2). Protokol rutin hale gelene kadar, ileriye götürülmeyen CEX elüs fraksiyonlarının, uyg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Carissa Grose, Jen Melhalko ve Matt Drew Protein İfade Laboratuvarı, Frederick Ulusal Laboratuvarı Kanser Araştırma için klonlama ve ifade desteği kabul ediyoruz. Bu proje tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Sözleşme No altında Federal fonlar ile finanse edilmiştir. HHSN261200800001E. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsanI Hizmetler Bakanlığı’nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmadığı gibi ticari adlardan, ticari ürünlerden veya kuruluşlardan bahsetmek de ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
References
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer’s disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
