Fullständigt bearbetat rekombinant KRAS4b: isolerar och karakteriserar det farnesylerade och metylerade proteinet
Summary
Prenylering är en viktig modifiering av perifera membran bindnings proteiner. Insekts celler kan manipuleras för att producera farnesylerade och karboxymetylerade KRAS4b i mängder som möjliggör biofysiska mätningar av interaktioner mellan protein och protein och lipider
Abstract
Proteinprenylering är en viktig modifiering som är ansvarig för att rikta proteiner till intracellulära membran. KRAS4b, som är muterad i 22% av mänskliga cancerformer, bearbetas av farnesylation och karboxymetylering på grund av närvaron av en “CAAX” låda motiv på C-Terminus. Ett konstruerat baculoviridae-system användes för att uttrycka farnesylerade och karboxymetylerade KRAS4b i insekts celler och har beskrivits tidigare. Här beskriver vi den detaljerade, praktiska renings-och biokemiska karakteriseringen av proteinet. Specifikt användes affinitet och jonbyteskromatografi för att rena proteinet till homogenitet. Intakt och infödd masspektrometri användes för att validera den korrekta modifieringen av KRAS4b och för att verifiera nukleotidbindning. Slutligen, membran Association av farnesylated och karboxymetylerade KRAS4b till liposomer mättes med hjälp av ytan plasmon resonans spektroskopi.
Introduction
Posttranslationella modifieringar spelar en viktig roll för att definiera proteiners funktionella aktivitet. Förändringar såsom fosforylering och glykosylering är väl etablerade. Lipid modifieringar är mindre väl kännetecknas, dock. Det uppskattas att så mycket som 0,5% av alla cellulära proteiner kan vara prenylated1. Prenylation är överföringen av en 15-kol enzymet eller en 20-kol geranylgeranyl lipid kedja till ett acceptor protein som innehåller caax motiv2. Prenylerade proteiner har varit inblandade i utvecklingen av flera mänskliga sjukdomar inklusive för tidigt åldrande3, Alzheimers4, hjärtdysfunktion5, choroideremia6, och cancer7. De små GTPases, HRAS, NRAS, och KRAS1, nukleära lamininer, och kinetochores cenp-E och F är farnesylated proteiner under basal villkoret. Andra små GTPases, nämligen RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, och RRAS är geranylgeranylated8, medan rhob kan vara farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lilla GTPase KRAS4b fungerar som en molekylär switch, i huvudsak sänder extracellulära tillväxtfaktor signalering till intracellulära signaltransduktion vägar som stimulerar celltillväxt och spridning, via flera protein-protein interaktioner. Det finns två viktiga aspekter av KRAS4b biokemi som är viktiga för dess verksamhet. Först, proteinet cykler mellan en inaktiv BNP och en aktiv GTP bunden stat där den aktivt engagerar med effectors. För det andra, en C-Terminal Poly-Lysine regionen och en farnesylated och karboxymetylerade cystein direkt proteinet till plasmamembranet, möjliggör rekrytering och aktivering av nedströms effectors. Mutant KRAS4b är en onkogena förare i bukspottskörteln, kolorektal, och lungcancer10, och som sådan, terapeutiska ingrepp skulle ha en enorm klinisk nytta. Framställning av autentiskt modifierat rekombinant protein som är farnesylerat och karboxymetylerat skulle möjliggöra biokemisk screening med KRAS4b i kombination med membran surrogat såsom liposomer eller lipidnanoskivor11,12.
Enzymet transferas (FNT) katalyserar tillsatsen av enzymet pyrofosfat till C-terminalen cystein i caax motiv i KRAS4b. Efter prenylering, är proteinet smugglas till endoplasmatiska Retikulum (ER) där ras omvandla enzymet (RCE1) klyver de tre C-Terminal rester. Det sista steget i behandlingen är metylering av den nya C-terminalen farnesylcystein rester av ER membranprotein, isoprenylcystein karboxyl metyltransferas (ICMT). Uttryck för rekombinant KRAS4b i E. coli resulterar i produktion av ett icke modifierat protein. Tidigare försök att producera bearbetade KRAS4b har begränsats på grund av otillräcklig avkastning för strukturella eller Drug screening experiment eller har misslyckats med att recapitulate den infödda fullängds mogna protein13,14. Det protokoll som presenteras här använder en konstruerad Baculovirus-baserade insekt cell Expression system och reningsmetod som genererar mycket renas, fullt bearbetade KRAS4b på avkastningen på 5 mg/L cellkultur.
Noggrann proteinkarakterisering är avgörande för att validera kvaliteten på rekombinanta proteiner innan man påbörjar strukturell biologi eller drog screening studier. Två viktiga parametrar för fullt bearbetade KRAS4b är validering av korrekt av modifiering och tillgängligheten av farnesylated och karboxymetylerade C-terminus (FME) för interaktion med membran substitut eller lipider. Electrospray jonisering masspektrometri (ESI-MS) av KRAS4b-FME användes för att mäta molekylvikt och bekräfta närvaron av enzymet och karboxymetylmodifikationer. Native masspektrometri, där proverna sprejas med nondenaturing lösningsmedel, användes för att visa att KRAS4b-FMe också var bunden till sin BNP-kofaktor. Slutligen användes ytplasmon resonans spektroskopi för att mäta den direkta bindningen av KRAS4b-FMe med immobiliserade liposomer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som nämnts i avsnittet representativa resultat är det mest kritiska steget under rening hanteringen av provet under den tid det är i lägre salt. Att begränsa den tid som provet utsätts för mindre än 200 mM NaCl hjälper till att minska nederbörden och öka prov avkastningen. Tolkningen av resultaten av CEX kan vara svår om profilen inte motsvarar förväntningarna (se figur 2). Fram till dess att protokollet har blivit rutinmässigt, rekommenderas att de CEX-elutionsfraktioner som …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner kloning och uttrycks stöd från Carissa Grose, Jen Melhalko, och Matt Drew i protein Expression Laboratory, Frederick National laboratorium för cancer forskning. Detta projekt har finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, enligt kontrakt nr. HHSN261200800001E. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller politik Institutionen för hälsa och mänskliga tjänster, inte heller nämner handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer innebär godkännande av den amerikanska regeringen
Materials
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7×14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima – L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare – Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
References
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer’s disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
