Summary
Die gesamte 3D-Struktur und der zelluläre Gehalt von Organoiden sowie ihre phänotypische Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Gewebe können mit dem hier beschriebenen einzelligen 3D-Bildgebungsprotokoll erfasst werden. Dieses Protokoll kann auf eine breite Palette von Organoiden mit unterschiedlichem Ursprung, Größe und Form angewendet werden.
Abstract
Organoid-Technologie, in vitro 3D-Kultivierung von Miniaturgewebe, hat ein neues experimentelles Fenster für zelluläre Prozesse geöffnet, die Organentwicklung und Funktion sowie Krankheitsteuern. Die Fluoreszenzmikroskopie hat eine wichtige Rolle dabei gespielt, ihre zelluläre Zusammensetzung im Detail zu charakterisieren und ihre Ähnlichkeit mit dem Gewebe, aus dem sie stammen, zu demonstrieren. In diesem Artikel stellen wir ein umfassendes Protokoll zur hochauflösenden 3D-Bildgebung ganzer Organoide bei immunfluoreszierender Etikettierung vor. Diese Methode ist weit verbreitet für die Abbildung von Organoiden unterschiedlich in Herkunft, Größe und Form. Bisher haben wir die Methode auf Atemwege, Dickdarm-, Nieren- und Leberorganoide angewendet, die aus gesundem menschlichen Gewebe stammen, sowie auf menschliche Brusttumororganoide und Maus-Mamma-Organoide. Wir verwenden ein optisches Clearing-Mittel, FUnGI, das die Erfassung ganzer 3D-Organoide mit der Möglichkeit der einzelligen Quantifizierung von Markern ermöglicht. Dieses dreitägige Protokoll von der organoiden Ernte bis zur Bildanalyse ist für die 3D-Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie optimiert.
Introduction
Die Weiterentwicklung neuartiger Kulturmethoden, wie der Organoidtechnologie, hat die Kultur der Orgeln in einem Gerichtermöglicht 1. Organoide wachsen zu dreidimensionalen (3D) Strukturen, die ihr Ursprungsgewebe ressemble, da sie phänotypische und funktionelle Eigenschaften bewahren. Organoide sind jetzt entscheidend für die Behandlung grundlegender biologischer Fragen2, Modellierung von Krankheiten einschließlich Krebs3, und die Entwicklung personalisierter Behandlungsstrategien4,5,6,7. Seit dem ersten Protokoll zur Erzeugung von Organoiden, die aus darmen adulten Stammzellen abgeleitet sind8, Organoid-Technologie hat sich erweitert, um eine breite Palette von gesunden und Krebsgewebe aus Organen einschließlich Prostataabgeleitet gehören9 , Gehirn10, Leber11,12, Magen13, Brust14,15, Endometrium16, Speicheldrüse17, Geschmack Sknospe18, Bauchspeicheldrüse19, und Niere20.
Die Entwicklung von Organoiden hat mit dem Aufstieg neuer volumetrischer Mikroskopie-Techniken zueinem, die die Architektur des gesamten Reitgewebes in 3D21,22,23,24visualisieren können. Die 3D-Bildgebung ist der herkömmlichen 2D-Gewebesektionsbildgebung bei der Visualisierung der komplexen Organisation biologischer Proben überlegen. 3D-Informationen erweisen sich als wesentlich für das Verständnis der zellulären Zusammensetzung, Zellform, Zell-Fate-Entscheidungen und Zell-Zell-Wechselwirkungen intakter biologischer Proben. Zerstörungsfreie optische Schnitttechniken wie konfokale oder multiphotonenlasersperkpere Mikroskopie (CLSM und MLSM) und Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglichen nun die kombinierte Visualisierung sowohl feiner Details als auch allgemeiner Gewebearchitektur innerhalb einer einzigen biologischen Probe. Dieser leistungsstarke bildgebende Ansatz bietet die Möglichkeit, die strukturelle Komplexität zu untersuchen, die mit Organoiden25 modelliert werden kann, und die räumliche Verteilung, die phänotypische Identität und den zellulären Zustand aller einzelnen Zellen, die diese 3D-Strukturen bilden, abzubilden.
Kürzlich haben wir ein detailliertes Protokoll für hochauflösende 3D-Bildgebung von festen und gelöschten Organoiden26veröffentlicht. Dieses Protokoll wurde speziell für die Verarbeitung empfindlicher organoider Strukturen entwickelt und optimiert, im Gegensatz zu Methoden für große intakte Gewebe wie DISCO27,28, CUBIC29,30,31und CLARITY32,33. Als solche, Diese Methode ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Organoiden unterschiedlich in Herkunft, Größe und Form und Zellgehalt. Darüber hinaus ist unser Protokoll im Vergleich zu anderen volumetrischen Bildgebungsprotokollen, die oft viel Zeit und Aufwand erfordern, anspruchslos und kann innerhalb von 3 Tagen abgeschlossen werden. Wir haben unser 3D-Bildgebungsprotokoll angewendet, um die Architektur und zelluläre Zusammensetzung von neu entwickelten Organoidsystemen aus verschiedenen Geweben zu visualisieren, einschließlich menschlicher Atemwege34, Niere20, Leber11und menschliche Brustkrebsorganoide15. In Kombination mit mehrfarbigen fluoreszierenden Linienverfolgung, Wurde diese Methode auch verwendet, um die Biopotenz von Basalzellen in Maus-Mamma-Organoiden zu offenbaren14.
Hier verfeinern wir das Protokoll durch die Einführung des ungiftigen Clearingmittels FUnGI35. Das FUnGI-Clearing wird in einem einzigen Inkubationsschritt erreicht, ist aufgrund seiner Viskosität einfacher zu montieren und bewahrt die Fluoreszenz während der Lagerung besser. Darüber hinaus führen wir Natriumdodecylsulfat (SDS) in den Waschpuffer ein, um kerntechnische Färbungen zu verbessern, sowie ein Silikon-basiertes Montageverfahren zur einfachen Folienvorbereitung vor der Mikroskopie. Abbildung 1 bietet einen grafischen Überblick über das Protokoll (Abbildung 1A) und Beispiele für 3D-bildende Organoide (Abbildung 1B-D). Kurz gesagt, Organoide werden aus ihrer 3D-Matrix zurückgewonnen, fixiert und immunmarkiert, optisch gelöscht, mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet und dann mit Visualisierungssoftware 3D gerendert.
Protocol
Die Verwendung von von Mäusen abgeleiteten Organoiden entsprach den regulatorischen Standards und wurde von der Animal Ethics Committee des Walter and Eliza Hall Institute (WEHI) genehmigt. Alle humanen Organoidproben wurden über die Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl) aus Biobanken entnommen. Die Zulassungen wurden vom Medical Ethical Committee der UMC Utrecht (METC UMCU) auf Antrag des HUB eingeholt, um die Einhaltung des niederländischen Gesetzes über die medizinische Forschung unter Einbeziehung menschlicher Subjekte zu gewährleisten, und die Zustimmung der Spender wurde gegebenenfalls von den Spendern eingeholt.
1. Herstellung von Reagenzien
- Um 4% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) zuzubereiten, 400 ml Phosphat-gepufferter Salzsäure (PBS) in einem Wasserbad auf knapp 60 °C erhitzen. 20 g PFA-Pulver hinzufügen und mit einem Rührwerk auflösen.
- Als nächstes fügen Sie ein paar Tropfen von 10 M NaOH hinzu. Auf Eis abkühlen lassen und ein paar Tropfen 10 M HCl hinzufügen, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Mit PBS auf 500 ml aufladen und aliquot (bei -20 °C für bis zu 2 Monate lagern).
HINWEIS: Erhitzen Sie nicht über 60 °C, um eine Verschlechterung des PFA zu vermeiden. Zubereitungszeit = 4 h.
- Als nächstes fügen Sie ein paar Tropfen von 10 M NaOH hinzu. Auf Eis abkühlen lassen und ein paar Tropfen 10 M HCl hinzufügen, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Mit PBS auf 500 ml aufladen und aliquot (bei -20 °C für bis zu 2 Monate lagern).
- Um PBS mit Tween-20 (PBT) (0,1% v/v) vorzubereiten, fügen Sie 1 ml Tween-20 bis 1 L PBS hinzu (bei 4 °C für bis zu 4 Wochen lagern).
HINWEIS: Vorbereitungszeit = 10 min. - Zur Zubereitung von 100 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 18,6 g EDTA und 2,5 g NaOH auf 80 ml dH2O hinzufügen. PH auf 8 mit 1 M NaOH einstellen und mit dH2O auf 100 ml füllen.
- Um 500 ml von 1 M Tris vorzubereiten, lösen Sie 60,55 g Tris mit 42 ml konzentriert (36-38%) HCl in 300 ml dH2O. PH auf 8 einstellen und auf 500 ml füllen.
- Zur Herstellung des organoiden Waschpuffers (OWB) 1 ml Triton X-100, 2 ml 10% (w/v) SDS und 2 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 1 L PBS (bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern)
HINWEIS: Vorbereitungszeit = 10 min. - Um 220 ml FUnGI herzustellen, mischen Sie 110 ml Glycerin mit 20 ml dH2O, 2,2 ml Tris-Puffer (1 M, pH 8,0) und 440 l EDTA (0,5 m). 50 g Fructose hinzufügen und bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln mischen, bis sie aufgelöst sind. Wenn klar, 49 g Fructose hinzufügen und mischen, bis gelöst. Dann 33,1 g Harnstoff hinzufügen und mischen, bis er gelöst ist (bei 4 °C im Dunkeln lagern).
HINWEIS: Erhitzen Sie nicht, da Fructose bei höheren Temperaturen karamellisiert. FUnGI besteht aus 50% (v/v) Glycerin, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM Tris Basis, 1,1 mM EDTA, 2,5 Mio. Fructose und 2,5 Mio. Harnstoff. Zubereitungszeit = 1 Tag. - Zur Herstellung von PBS-BSA (1% w/v) 1 g BSA in 100 ml PBS auflösen (bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern).
HINWEIS: Vorbereitungszeit = 10 min.
2. Organoide Erholung
HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten für Organoide, die in Kellermembranextrakt (BME) angebaut werden und in einer 24-Well-Platte mit einer Größe von 100 bis 500 m kultiviert wurden.
- Das Kulturmedium ansaugen und 1x mit eiskaltem PBS waschen. Vermeiden Sie eine Unterbrechung der 3D-Matrix.
- Legen Sie die Platte auf Eis und fügen Sie 1 ml eiskalte Zell-Recovery-Lösung (Tabelle der Materialien) zu jedem Brunnen. 30 bis 60 min bei 4 °C auf einem horizontalen Shaker (40 Rpm) inkubieren.
HINWEIS: Die 3D-Matrixtröpfchen sollten vollständig gelöst werden. - Beschichten Sie eine 1 ml Pipettenspitze mit BSA, indem Sie 1% PBS-BSA eintauchen und 2x nach oben und unten pfeifen. Diese Beschichtung verhindert, dass Organoide an der Spitze kleben. Um die Innenseite eines 15 ml konischen Rohres zu beschichten, mit 5 ml 1% PBS-BSA füllen, 2x 3x umkehren und die PBS-BSA entsorgen.
HINWEIS: Diese Beschichtung ist für alle Kunststoff-Verbrauchsmaterialien bis zur Fixierung erforderlich (Schritt 3.3). - Mit einer beschichteten Spitze den Inhalt des Brunnens vorsichtig 5x 5x aufheben und die Organoide in beschichtete 15 ml-Röhren übertragen. Organoide aus verschiedenen Brunnen mit der gleichen Identität können in die gleiche Röhre gepoolt werden.
- Fügen Sie 1 ml eiskalte 1% PBS-BSA zu jeder Kultur gut zu spülen und sammeln alle Organoide.
- Fügen Sie kalte PBS auf 10 ml und drehen Sie für 3 min bei 70 x g und 4 °C, um ein enges Pellet ohne eine sichtbare Schicht von 3D-Matrix zu erhalten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
3. Fixierung und Blockierung
- Die Organoide in 1 ml eiskaltem PFA mit einer beschichteten 1 ml Spitze vorsichtig wieder aufsetzen.
- Fix bei 4 °C für 45 min. Unterbrechen Sie die Organoide vorsichtig auf halbem Weg durch die Fixierungszeit mit einer beschichteten 1 ml Spitze, um eine gleichmäßige Fixierung zwischen allen Organoiden zu gewährleisten.
- 10 ml eiskaltes PBT in die Röhre geben, vorsichtig mischen, durch Invertieren der Röhre, 10 min inkubieren und bei 70 x gdrehen, beide bei 4 °C.
HINWEIS: Ab diesem Schritt ist die Beschichtung von Spitzen in der Regel nicht erforderlich, da die meisten Organoidtypen nach der Fixierung nicht an der Spitze kleben. Einige Organoide können jedoch auch nach der Fixierung beschichtete Kunststoffe benötigen. - Blockieren Sie die Organoide, indem Sie das Pellet in eiskaltem OWB (mindestens 200 L OWB pro Brunnen) wieder aufhängen und die Organoide auf eine 24 Well-Suspensionsplatte übertragen.
HINWEIS: Organoide aus einem großen Pellet können über mehrere Brunnen geteilt werden, um verschiedene Färbungen durchzuführen. - Bei 4 °C mindestens 15 min inkubieren.
4. Immunolabeling
- Pipette 200 l OWB in einem leeren Brunnen als Referenzbrunnen dienen.
HINWEIS: Die Immunkennzeichnung kann auch in 48- oder 96-Wells-Platten durchgeführt werden, um den Antikörperverbrauch zu reduzieren. Der Benutzer sollte sich jedoch bewusst sein, dass sowohl die Färbe- als auch die Waschleistung aufgrund des geringeren Volumens reduziert werden können. - Lassen Sie die Organoide an der Unterseite der Platte absetzen.
HINWEIS: Dies kann mit einem Stereomikroskop überprüft werden und wird durch die Verwendung eines dunklen Hintergrunds erleichtert. - Neigen Sie die Platte um 45° und entfernen Sie OWB und verlassen Sie die Organoide in 200 l OWB (verwenden Sie den Referenzbrunnen, um 200 l zu schätzen).
- Fügen Sie 200 L OWB mit primären Antikörpern 2x konzentriert (z.B. E-Cadherin [1:400] und Ki67 [1:200] für Ergebnisse in Abbildung 1hinzu; Keratin 5 [1:500], Keratin 8/18 [1:200], MRP2 [1:50] und Ki67 [1:200] für Ergebnisse in Abbildung 2) und über Nacht bei 4 °C inkubieren, während leicht geschaukelt/schütteln (40 Rpm auf horizontalem Shaker).
- Fügen Sie am nächsten Tag 1 ml OWB hinzu.
- Lassen Sie die Organoide an der Unterseite der Platte für 3 min absetzen. Entfernen Sie OWB und lassen Sie 200 l in der Platte. 1 ml OWB hinzufügen und 2 h mit leichtem Schaukeln/Schütteln waschen.
- Wiederholen Sie Schritt 4.6 zwei weitere Male.
- Lassen Sie die Organoide an der Unterseite der Platte für 3 min absetzen. Entfernen Sie OWB und lassen Sie 200 L im Brunnen.
- Fügen Sie 200 L OWB mit sekundären Antikörpern, konjugierten Antikörpern und Farbstoffen 2x konzentriert hinzu (z. B. DAPI [1:1000], Ratte-AF488 [1:500], Maus-AF555 [1:500], Phalloidin-AF647 [1:100] für Ergebnisse in Abbildung 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], kaninchen-AF555 [1:500], Maus-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] für Ergebnisse in Abbildung 2; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] für Ergebnisse in Abbildung 3) und über Nacht bei 4 °C inkubieren, während leicht geschaukelt/geschüttelt wird.
- Wiederholen Sie am nächsten Tag die Schritte 4.5 x 4.7.
- Die Organoide in ein 1,5 ml-Rohr geben und bei 70 x g 3 min nach unten drehen.
5. Optische Räumung von Organoiden
- Entfernen Sie so viel wie möglich den OWB durch Pipettieren, ohne die Organoide zu stören.
- Fügen Sie FUnGI (mindestens 50 l, RT) mit einer 200-L-Spitze mit abgeschnittenem Ende hinzu und setzen Sie sie vorsichtig wieder auf, um Blasenbildung zu verhindern. Inkubieren bei RT für 20 min.
HINWEIS: Optische Sausung durch FUnGI kann zu geringfügigen Gewebeschrumpfungen führen. Dies hat keinen Einfluss auf die allgemeine Morphologie von ein- und mehrschichtigen Organoiden; Sphärisch geformte monolagige Organoide mit großen Lumen können jedoch zusammenbrechen. Das Protokoll kann hier angehalten und Proben bei 4 °C (mindestens 1 Woche) oder bei -20 °C (mindestens 6 Monate) gelagert werden.
6. Diavorbereitung für konfokale Bildgebung
- Bereiten Sie eine 10 ml Spritze mit einem Silikondichtmittel(Materialtabelle). Befestigen Sie eine 200-L-Spitze und schneiden Sie das Ende ab, um nach dem Drücken der Spritze einen sanften Fluss des viskosen Silikons zu ermöglichen. Verwenden Sie die Spritze, um ein Rechteck von 1 cm x 2 cm in der Mitte eines Dias zu zeichnen.
- Schneiden Sie das Ende einer 200-L-Spitze ab und übertragen Sie die Organoide in FUnGI in die Mitte des Rechtecks.
- Legen Sie einen Coverslip oben. Um eingeschlossene Luftblasen zu minimieren, legen Sie zuerst die linke Seite des Deckels, senken Sie dann langsam den Deckelrutsch von links nach rechts, bis keine eingeschlossene Luft vorhanden ist, und lassen Sie dann den Deckelschlupf los.
HINWEIS: Abstandshalter, die ähnlich groß sind, um die Organoide zu verhindern, dass sie beschädigt werden. - Setzen Sie vorsichtig Druck auf alle Kanten des Deckels, um ihn fest am Silikondichtmittel zu befestigen. Die Folie ist nun für die Bildgebung bereit.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten und die Probe bei 4 °C (mindestens 1 Woche) oder -20 °C (für mindestens 6 Monate) gelagert werden.
7. Bildaufnahme und -verarbeitung
- Mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Tabelle der Materialien), Bild der Folie mit einem Multi-Tauch25x oder Öl-Immersion 40x Objektiv für konfokale Bildgebung.
- Verwenden Sie die folgenden Erfassungseinstellungen für das 25-fache Objektiv: Scanmodusrahmen, Framegröße 1024 x 1024, Voxelgröße 332 nm x 332 nm x 1,2 m, Pixelverweilzeit <2 s, bidirektionales Scannen, Mittelwert 1, Bittiefe 8. Um die Photobleaching zu reduzieren, verwenden Sie eine geringe Laserleistung (<5% im Allgemeinen, <10% für schwache Färbung).
- Verwenden Sie den Z-Stack-Modus, um die untere und obere Grenze zu definieren und die Größe des Z-Schritts auf optimal festzulegen. Wenn Sie große organoide Strukturen oder mehrere Organoide zusammen bildgeben, verwenden Sie den Kachelmodus mit 10% Überlappung und zeigen den Interessenbereich an.
HINWEIS: Bei diesen Einstellungen beträgt die Datengröße für ein typisches Organoid mit einem Durchmesser von <300 m <1 GB.
- Für Kachel-Scan-Datensätze, nähen Sie die Bildgebungsdateien in der Software mit dem Mikroskop(Tabelle der Materialien). Wählen Sie im Bearbeitungsabschnitt Stitching als Methode aus, wählen Sie Neue Ausgabe unter Parameter nund die zu heftende Datei aus. Drücken Sie AufTragen, um mit dem Heften zu beginnen.
- Erhalten Sie eine 3D-rendernDarstellung der Bildgebung unter der Registerkarte 3D-Ansicht in der Imaging-Software (Tabelle der Materialien) und optimieren Sie anschließend Helligkeits-, Kontrast- und 3D-Rendering-Eigenschaften. Exportieren Sie RGB-Snapshots der Ergebnisse als TIFF-Dateien.
Representative Results
Bildgebende Organoide in 3D ermöglichen die Visualisierung von Architektur, zellulärer Zusammensetzung sowie intrazellulären Prozessen im Detail. Die vorgestellte Technik ist anspruchslos und kann vermutlich auf eine Breite von Organoidsystemen angewendet werden, die aus verschiedenen Organen oder Wirtsarten abgeleitet sind.
Die Stärke der 3D-Bildgebung im Vergleich zur 2D-Bildgebung wird durch Bilder von Maus-Mamma-Drüsenorganoiden veranschaulicht, die mit kürzlich veröffentlichten Methoden14erzeugt wurden. Die zentrale Schicht dieser Organoide besteht aus säulenförmigen K8/K18-positiven Leuchtlichtzellen und die äußere Schicht enthält längliche K5-postive Basalzellen (Abbildung 2A), die die Morphologie der Brustdrüse in vivo rekapitulieren. Diese polarisierte Organisation ist eine Herausforderung, die von einem 2D-optischen Abschnitt desselben Organoids(Abbildung 2B, mittleres Panel) zu schätzen ist. Ein weiteres Beispiel für eine komplexe Struktur, die ohne 3D-Informationen nicht zu interpretieren ist, ist das Netzwerk von MRP2-positiven Canaliculi, die die Sammlung der Gallenflüssigkeit menschlicher Leberorganoide erleichtern11 (Abbildung 2B). Dies veranschaulicht, wie unsere Methode die Visualisierung wesentlicher struktureller Merkmale von Organoiden ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die erhaltene Qualität und Auflösung eine halbautomatische Segmentierung und Bildanalyse. So können die Gesamtzahl der Zellzahlen und das Vorhandensein von Markern in bestimmten zellulären Subtypen in ganzen Organoiden quantifiziert werden. Wir veranschaulichen dies, indem wir die Kerne eines ganzen Organoids segmentieren, das 140 Zellen enthält, von denen 3 Zellen eine hohe Positivität für den Ki67-Zellzyklusmarker aufweisen (Abbildung 2C). Der DAPI-Kanal wird als Quellkanal ausgewählt, und Segmente werden basierend auf einem Intensitätsschwellenschritt und einem Kugeldurchmesser von 10 m generiert. Berührende Objekte werden nach Regionen aufgeteilt, die aus Ausgangspunkten wachsen. Schließlich wird ein Größenfilter von 10 Voxeln angewendet, um kleine geräuschinduzierte Segmente zu entfernen. Für jedes Segment, das einen Kern darstellt, wird dann die mittlere Intensität des Ki67-Kanals zum Plotten exportiert.
Kürzlich haben wir das optische Clearingmittel FUnGI35entwickelt, das wir nun in dieses Protokoll integriert haben, um die Transparenz der Organoide zu verfeinern. FUnGI ist einfach zu bedienen, da die Clearing-Reinigung durch einen einzigen Inkubationsschritt nach immunfluoreszierender Färbung leicht erreicht wird. Ein zusätzlicher Vorteil des Mittels ist seine Viskosität, die die Probenhandhabung während der Folienmontage erleichtert. Fluoreszierende Proben in FUnGI bewahren ihre Fluoreszenz auch dann, wenn sie mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden. Wir zeigen, dass FUnGI ungeklärte und Fructose-Glyzerin in fluoreszierender Signalqualität tief im Organoid übertrifft (Abbildung 3A,B), und dass FunGI-gereinigte Organoide insgesamt eine erhöhte Fluoreszenzintensität im Vergleich zu ungeklärten Organoiden haben ( Abbildung3C).
Zusammenfassend beschreiben wir eine anspruchslose, reproduzierbare 3D-Bildgebungstechnik zur Erfassung volumetrischer Daten immunomarkierter Organoide. Dieses Protokoll kann leicht verwendet werden, um eine Vielzahl von Organoiden, einschließlich der erbmaus- und menschennahe, aus gesunden und Krankheitsmodellen abzubilden. Die einfache Probenvorbereitung kann angepasst werden, um konfokale, Multiphotonen- und Lichtbogenfluoreszenzmikroskope zu ermöglichen, um eine zelluläre bis subzelluläre Auflösung ganzer Organoide zu erhalten.
Abbildung 1: Schematische Übersicht des hochauflösenden 3D-Bildgebungsprotokolls. Organoide werden aus ihrer 3D-Matrix wiederhergestellt. Die Fixierung und Blockierung erfolgt vor der Immunkennzeichnung mit Antikörpern und Farbstoffen. Die optische Rodung erfolgt in einem einzigen Schritt mit dem FUnGI-Clearing-Agent. Die 3D-Wiedergabe von Bildern kann mit Bildgebungssoftware durchgeführt werden. (A) Schematische Übersicht über das Verfahren. (B) Gelöschtes 3D-Konfokalbild eines menschlichen kolonischen Organoids, das für F-Actin und E-Cadherin (E-cad) (25x Ölobjektiv) gekennzeichnet ist. Skalenbalken = 40 m. (C) Gelöschtes 3D-Konfokalbild mit ganzer Montage. Skalenbalken = 20 m. (D) Vergrößerter optischer Abschnitt eines menschlichen kolonischen Organoids immunlabeled für F-Actin, E-Cadherin (E-cad) und Ki67 (25x Ölobjektiv). Skalenbalken = 5 m. Diese Zahl wurde von Dekkers et al.26geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Volumetrische Bildgebung visualisiert komplexe 3D-Architektur. Konfokale Bilder, die 3D-Datensätze (linkes Bedienfeld), optische 2D-Abschnitte (mittleres Panel) und 3D-Bereiche eines vergrößerten Bereichs (rechtes Panel) darstellen. (A) Ein Organoid, das aus einer einzigen Basalzelle der Mausbrustdrüse abgeleitet wird, die die 3D-Organisation von länglichen Brustbasalzellen veranschaulicht, die luminale Zellen umgeben oder für K8/18, K5 und F-Actin beschriftet sind (Fructose-Glyzerol-Clearing; 25-faches Ölobjektiv). Die Skalenbalken repräsentieren 55 m (linkes Panel) und 40 m (mittlere und rechte Paneele). (B) Ein menschliches fetales Leberorganoid mit einem komplexen 3D-Netzwerk von MRP2-positiven Canaliculi, gekennzeichnet für DAPI, MRP2 und F-Actin (Fructose-Glyzerol-Clearing; 40x Ölobjektiv). Die Skalenbalken repräsentieren 25 m (linkes Panel) und 8 m (mittlere und rechte Paneele). (C) Konfokales 3D-Gesamtbild eines menschlichen fetalen Leberorganoids mit DAPI und Ki67 (linkes Panel) und einem segmentierten Bild auf dem DAPI-Kanal mit Bildgebungssoftware (mittleres Panel). Skalenbalken = 15 m. Diagramm dargestellt, das die mittlere Ki67-Intensität in allen Zellen (DAPI-segmentiert) des gesamten Organoids (140 Zellen) (rechtes Panel) darstellt. Diese Zahl wurde von Dekkers et al.26geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Optische Simederung von Organoiden mit FUnGI. (A) Repräsentative Bilder menschlicher Kolonphyide, die mit F-Actin (grün) und DAPI (grau) beschriftet und ohne Lichtung abgebildet, mit Fructose-Glyzerin gelöscht oder mit FUnGI (25x Ölobjektiv) gelöscht werden. Linkes Panel: 3D-Rendering des Organoids. Rechte S-Platte: optischer Abschnitt des Organoids in 150 m Tiefe. Für den Zustand "keine Lichtung" musste die Helligkeit des Bildes im Vergleich zu den Bedingungen "Fructose-Glycerol" und "FUnGI" erhöht werden, um das Organoid zu visualisieren. Skalenbalken = 50 m. (B) Nichtlineare Regressionsanpassung, die die Abnahme der DAPI-Intensität mit zunehmender Z-Tiefe für verschiedene optische Clearingmethoden anzeigt. Die Werte stellen die Intensitäten einzelner Zellen dar, die durch dAPI-Segmentierung erkannt werden, und werden auf die durchschnittliche DAPI-Intensität der ersten 50 m des Organoids normalisiert. Um eine Unterschätzung der Dämpfung durch hellere Zellen an den tieferen Rändern und aufkeimenden Strukturen zu vermeiden, wurden nur die Mittelregionen der Organoide analysiert. (C) Drei Organoide pro Zustand ähnlicher Größe und Tiefe zum Deckschein wurden mit identischen Mikroskopeinstellungen abgebildet. Die vollständigen 3D-Datasets wurden einzeln zellig auf DemAPI-Signal zum Vergleich segmentiert. Balkendiagramm mit durchschnittlicher DAPI-Intensität mit unterschiedlichen Clearingmethoden für vollständige segmentierte Datasets. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Werte sind Intensitäten von >3800 einzelnen Zellen, die durch DAPI-Segmentierung erkannt werden. = p < 0.0001, Kruskal-Wallis-Test mit zweiseitigem Dunn-Mehrfachvergleich nach dem Hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Hier haben wir ein detailliertes Protokoll zur 3D-Bildgebung intakter Organoide mit einzelliger Auflösung vorgelegt. Um dieses Protokoll erfolgreich ausführen zu können, müssen einige wichtige Schritte unternommen werden. In diesem Abschnitt werden diese Schritte hervorgehoben und die Fehlerbehebung angezeigt.
Der erste kritische Schritt ist das Entfernen der 3D-Matrix. Die meisten Organoide werden in vitro mit der Verwendung von Matrizen vermehrt, die die extrazelluläre In-vivo-Umgebung imitieren, um die Bildung gut polarisierter 3D-Strukturen zu verbessern. Eine Fixierung und nachfolgende Färbung innerhalb der 3D-Matrix ist möglich, kann aber für das Eindringen von Antikörpern nachteilig sein oder ein hohes Hintergrundsignal erzeugen (Daten werden nicht angezeigt). Effiziente Entfernung von Matrizen kann durch die Art der Matrix, die Menge und Größe der Organoide und verlängerte Kultivierung beeinflusst werden. Daher kann eine Optimierung für unterschiedliche Kulturbedingungen erforderlich sein. Für Organoide, die in Matrigel oder BME kultiviert werden, reicht ein 30-60-min-Schritt in der eiskalten Zellrückgewinnungslösung aus, um die Matrix aufzulösen, ohne die Organoide zu schädigen. Darüber hinaus könnte die Entfernung der unterstützenden 3D-Matrix zum Verlust einheimischer Strukturen und zur Störung von organoiden Kontakten mit anderen Zelltypen führen, z. B. wenn Organoide mit Fibroblasten oder Immunzellen kokultiviert werden. Darüber hinaus ist eine optimale organoide Fixierung entscheidend für die Erhaltung der 3D-Gewebearchitektur, die Proteinantigenität und die Minimierung der Autofluoreszenz. Die Fixierung für 45 min mit 4% PFA bei 4 °C ist normalerweise ausreichend für die Kennzeichnung einer breiten Palette von Organoiden und Antigenen. Allerdings ist ein längerer Fixierungsschritt, bis zu 4 h, in der Regel besser geeignet für Organoide, die fluoreszierende Reporterproteine exezieren, erfordert aber eine Optimierung für verschiedene Fluorophore. Befestigungszeiten von weniger als 20 min reichen nicht aus, um F-Actin mit Phalloidin-Sonden richtig zu kennzeichnen. Ein weiteres häufiges Problem ist der Verlust von Organoiden während des Protokolls. Es ist daher wichtig, (i) Pipettenspitzen und Tuben sorgfältig mit 1% BSA-PBS zu beschichten, wie beschrieben, wenn sie mit unfixierten Organoiden umgehen, um zu verhindern, dass sie an Kunststoffen kleben, (ii) niedrighaften oder Suspensionsplatten verwenden, um zu verhindern, dass die Probe an der Platte klebt, und (iii) genügend Zeit zu lassen, damit sich die Organoide am Boden der Platte absetzen, bevor sie die Puffer vorsichtig entfernen. Pipettierviskose FUnGI kann Blasen einführen. Die Handhabung der gelöschten Probe bei RT verringert die Viskosität und verbessert die Benutzerfreundlichkeit, wodurch der Verlust von Organoiden minimiert wird. Während die meisten Organoide einfach zu handhaben sind, haben zystische Organoide mit einem vergrößerten Lumen eine hohe Neigung zu kollabieren, wenn sie mit 4% PFA fixieren oder mit FUnGI gelöscht werden. Dieser Effekt kann durch die Verwendung eines anderen Fixativs (z. B. Formalin oder PFA-Glutaraldehyd) reduziert, aber nicht vollständig verhindert werden. Dies könnte sich jedoch potenziell auf Autofluoreszenz, Antikörperdurchdringung und Epitopverfügbarkeit auswirken. Wenn zystische Organoide nach dem Löschen gefaltet erscheinen, wird empfohlen, den Clearingschritt und das Bild durch Multi-Photonenmikroskopie zu überspringen, die weniger durch Lichtstreuung behindert wird. Schließlich kann die Erlangung der gesamten 3D-Struktur von Organoiden eine Herausforderung sein und erfordert einen minimalen Abstand zwischen Coverslip und Organoid. Wenn Organoide platzig in ihrem Montagemittel haben, kann dies zu X- und Y-Verschiebungen führen, während daten in Z-Tiefe aufgezeichnet werden. Die Verwendung von weniger Silikondichtmittel während der Gleitvorbereitung kann die suboptimale Montage zwischen Deckel- und Mikroskopschlitten lösen. Jedoch, zu wenig Silikon kann zu organoiden Kompression und Verlust ihrer inhärenten 3D-Struktur führen. FUnGI verbessert die Handhabung für die Gleitmontage und Stabilität von Organoiden während der Bildgebung, aufgrund seiner höheren Viskosität.
Während dieses Protokoll für eine breite Palette von Anwendungen verwendet werden kann, um den zellulären Inhalt und die 3D-Architektur intakter Organoide eingehend zu untersuchen, sollten bestimmte Einschränkungen in Betracht gezogen werden. Diese Methode ist eher kostengünstig und zeitaufwändig. In der Tat sollten Benutzer bedenken, dass die Bildgebung großer intakter Organoide in 3D sowohl Fliesen als auch Probenerfassung in Z erfordert, was zu längeren Erfassungszeiten führt. Eine schnellere Bildgebung könnte durch den Einsatz von Mikroskop-Assets, einschließlich Resonanz- oder Spinnscheibenscanner, oder durch Lichtbogenmikroskop-Technologie26erreicht werden. Eine weitere Überlegung ist, dass Marker heterogen zwischen verschiedenen Organoiden aus derselben Probe exprimiert werden können. Daher sollten mehrere Organoide erworben werden, um diese organoide Heterogenität in der Kultur besser einzufangen. Während das gesamte Nasslaborverfahren einfach ist, erfordert die Nachbearbeitung von Daten Kenntnisse in Bildanalysesoftware für die 3D-Visualisierung und -Quantifizierung sowie Statistiken zum Mining aller im Datensatz vorhandenen Informationen.
In den letzten zehn Jahren hat sich der Bereich der Volumenbildgebung stark weiterentwickelt, sowohl aufgrund der Entwicklung einer breiten Palette von optischen Clearing-Agenten als auch der Verbesserungen in der Mikroskopie und den Computertechnologien27,30,31. Während in der Vergangenheit die meisten Studien konzentrierten sich auf großvolumige Bildgebung von Organen oder assoziierten Tumoren, in jüngerer Zeit Methoden für kleinere und empfindlichere Gewebe, einschließlich organoider Strukturen, wurdenentwickelt 36,37,38. Wir haben vor kurzem eine einfache und schnelle Methode zur Abbildung von Vollmontage-Organoiden unterschiedlicher Herkunft, Größe und Form auf Einzelzellebene für die nachfolgende 3D-Rendering- und Bildanalyse26veröffentlicht, die wir hier mit einigen Verbesserungen (z.B. FUnGI, Silikonmontage) und begleitet von einem Videoprotokoll vorgestellt haben. Diese Methode ist der herkömmlichen 2D-Sektions-basierten Bildgebung bei der Entschlüsselung komplexer Zellmorphologie und Gewebearchitektur überlegen (Abbildung 2) und einfach in Laboratorien mit einem konfokalen Mikroskop zu implementieren. Mit leichten Anpassungen an das Protokoll können die Proben kompatibel mit, super-Auflösung konfokale, Multi-Photon sowie Lichtbogen-Bildgebung, die dieses Protokoll weit anwendbar macht und bietet Benutzern ein leistungsfähiges Werkzeug, um besser zu verstehen, die multidimensionale Komplexität, die mit Organoiden modelliert werden kann.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir sind sehr dankbar für die technische Unterstützung durch das Princess Mxima Center for Pediatric Oncology und das Hubrecht Institute und Zeiss für die unterstützung und Zusammenarbeit in der Bildgebung. Die gesamte Bildgebung wurde im Bildzentrum der Prinzessin Méxima durchgeführt. Diese Arbeit wurde vom Princess Mxima Center for Pediatric Oncology finanziell unterstützt. JFD wurde von einem Marie Curie Global Fellowship und einem VENI-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unterstützt. Die ACR wurde von einem Startzuschuss des Europäischen Rates (ERC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| 2 ml safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Confocal microscope software ZEN | Zeiss | ZEN black/blue | |
| Conical tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
| Coverglass #1.5 24x60mm | Menzel-Glazer | G418-15 | |
| Coverglass #1.5 48x60mm | ProSciTech | G425-4860 | |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | dilution 1:1000 |
| Dissection Stereomicroscope | Leica | M205 FA | |
| Double sided sticky tape 12,7 mm 6,35 m | Scotch 3M | ||
| Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Focus Clear | CelExplorer | FC-101 | |
| Fructose | Sigma Aldrich | F0127 | |
| Glycerol | Boom | 76050771.0500 | |
| Graduated Transfer Pipets | Samco | 222-15 | |
| Horizontal shaker | VWR | 444-2900 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Ajax Firechem. | 265.2.5L-PL | 10M stock solution, corrosive |
| Imaris software | Bitplane | ||
| Microscope slides Superfrost | ThermoFisher | 10143352 | ground edge, 90 degrees 26 mm~76 mm |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500g | Hazardous |
| Phalloidin Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A22287 | dilution 1:100-200 |
| E-cadherin | ThermoFisher | 13-1900 | dilution 1:400 |
| Ki-67 | BD Biosciences | B56 | dilution 1:200 |
| Keratin 5 | BioLegend | 905501 | dilution 1:500 |
| Keratin 8/18 | DSHB (University of Iowa) | dilution 1:200 | |
| MRP2 | Abcam | ab3373 | dilution 1:50 |
| Secondary Rat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21208 | dilution 1:500 |
| Secondary Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31570 | dilution 1:500 |
| Secondary Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 | ThermoFisher | A-31572 | dilution 1:500 |
| Silicone Sealant | Griffon | S-200 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher | 28312 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | Merck Millipore | 567530 | 10 M stock solution, corrosive |
| Suspension cell culture plates | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
| Tris | Fisher Scientific | 11486631 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8532 | Hazardous |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| UltraPure Low Melting Point (LMP) Agarose | ThermoFisher | 16520050 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| Workstation | Dell |
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