3D Multicolor DNA FISH Outil pour étudier l'architecture nucléaire dans les cellules primaires humaines
Summary
3D multicolor DNA FISH représente un outil pour visualiser les loci génomiques multiples dans les noyaux préservés 3D, définissant sans ambiguïté leurs interactions réciproques et leur localisation dans l’espace nucléaire à un seul niveau cellulaire. Ici, un protocole étape par étape est décrit pour un large éventail de cellules primaires humaines.
Abstract
Une question majeure en biologie cellulaire est l’organisation génomique dans l’espace nucléaire et comment l’architecture de chromatine peut influencer des processus tels que l’expression des gènes, l’identité cellulaire et la différenciation. De nombreuses approches développées pour étudier l’architecture 3D du génome peuvent être divisées en deux catégories complémentaires : les technologies basées sur la conformation chromosomique (technologies C) et l’imagerie. Alors que le premier est basé sur la capture de la conformation chromosomique et des interactions d’ADN proximal dans une population de cellules fixes, le second, basé sur la fluorescence de l’ADN in situ hybridation (FISH) sur des noyaux conservés en 3D, permet la visualisation contemporaine de loci multiples à un seul niveau cellulaire (multicolor), examinant leurs interactions et leur distribution dans le noyau (3D MULTIcolor DNA FISH). La technique de l’ADN multicolore 3D FISH a une limitation de visualiser seulement quelques loci prédéterminés, ne permettant pas une analyse complète de l’architecture nucléaire. Cependant, compte tenu de la robustesse de ses résultats, 3D multicolor DNA FISH en combinaison avec la microscopie 3D et la reconstruction d’image est une méthode possible pour valider les résultats basés sur la technologie C et d’étudier sans ambiguïté la position et l’organisation de loci spécifiques au niveau d’une seule cellule. Ici, nous proposons une méthode étape par étape de 3D MULTIcolor DNA FISH adapté à un large éventail de cellules primaires humaines et discuter de toutes les actions pratiques, étapes cruciales, notions d’imagerie 3D et l’analyse des données nécessaires pour obtenir un succès et instructif 3D multicolore DNA FISH dans différents contextes biologiques.
Introduction
Les eucaryotes plus élevés doivent condenser et compacter systématiquement une énorme quantité d’informations génétiques dans l’espace 3D minute du noyau1,2,3,4. Aujourd’hui, nous savons que le génome est classé spatialement dans des compartiments et des domaines topologiquement associés5 et que les niveaux multiples de pliage de l’ADN génèrent des contacts entre différentes régions génomiques qui peuvent impliquer la formation de boucle de chromatine6,7. La boucle dynamique 3D de la chromatine peut influencer de nombreux processus biologiques différents tels que la transcription8,9, la différenciation et le développement10,11, réparation de l’ADN12,13, tandis que ses perturbations sont impliqués dans diverses maladies14,15,16 et les défauts de développement15,17,18.
De nombreuses approches ont été développées pour étudier l’organisation du génome 3D. Des technologies basées sur le capture de conformation de chromosome (C-technologies, 3C, 4C, 5C, Hi-C et dérivés) ont été développées pour étudier l’organisation de génome dans les cellules fixes3,4,19,20. Ces approches sont basées sur la capacité de capturer les fréquences de contact entre les loci génomiques à proximité physique. C-technologies, en fonction de leur complexité, attraper l’organisation mondiale du génome 3D et la topologie nucléaire d’une population cellulaire3,4,19,20. Néanmoins, les interactions 3D sont dynamiques dans le temps et l’espace, très variables entre les cellules individuelles composées d’interactions multiplexes, et sont largement hétérogènes21,22.
L’hybridation 3D de fluorescence in situ de l’ADN multicolore (FISH) est une technique qui permet la visualisation de loci génomiques spécifiques à un seul niveau de cellule, permettant une étude directe de l’architecture nucléaire 3D d’une manière complémentaire aux technologies C. Il représente une technologie actuellement utilisée pour valider sans ambiguïté les résultats C. 3D multicolor DNA FISH utilise des sondes étiquetées fluorescentes complémentaires aux loci génomiques d’intérêts. L’utilisation de différents fluorophores et d’équipements de microscopie appropriés permet la visualisation contemporaine de cibles multiples dans l’espace nucléaire23,24. Ces dernières années, FISH a été combiné avec les progrès technologiques dans la microscopie pour obtenir la visualisation des structures à échelle fine à haute résolution25,26 ou avec des approches CRISPR-Cas pour la visualisation des acides nucléiques en imagerie en direct27,28. Malgré une large adoption, l’approche 3D multicolor DNA FISH est encore considérée comme difficile dans de nombreux laboratoires car le matériel biologique utilisé doit être adapté.
Ici, nous fournissons un protocole complet pour 3D multicolor DNA FISH (de la préparation cellulaire / sonde à l’analyse des données) applicable à un large éventail de cellules primaires humaines, permettant la visualisation de loci génomiques multiples et la préservation de la structure 3D des noyaux. Afin d’étudier l’architecture nucléaire, la structure 3D des noyaux doit être préservée. Pour cette raison, contrairement à d’autres protocoles existants29,30,31, nous évitons l’utilisation d’un gradient d’alcool et le stockage des couvertures dans l’alcool qui peut affecter la structure de chromatine32. La méthode est adaptée à partir de protocoles FISH d’ADN 3D conservés24,33 à appliquer à un large éventail de cellules primaires humaines, à la fois isolées ex vivo ou cultivées in vitro. Il existe des paramètres de perméabilisation et de déprotéinisation pour différentes morphologies nucléaires et caractéristiques cytologiques (p. ex., différents degrés de compactage nucléaire, abondance de cytosquelettes)34. Ces paramètres sont souvent généralement décrits dans d’autres protocoles24,33, sans fournir une discrimination claire de la procédure au sein de différents types de cellules. En outre, nous avons développé un outil spécifique nommé NuCLD (localisateur de contacts nucléaires en 3D)16, fournissant des principes pour l’analyse des données qui permettra d’améliorer la proximité 3D entre les différents loci et leur distribution topologique nucléaire dans l’espace nucléaire d’une manière automatisée.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode actuelle décrit un protocole étape par étape pour effectuer 3D MULTIcolor DNA FISH sur un large éventail de cellules primaires humaines. Bien que l’ADN FISH soit une technologie largement utilisée, l’ADN 3D multicolore FISH sur les noyaux interphases 3D conservés est encore difficile à réaliser dans de nombreux laboratoires, principalement en raison des caractéristiques des échantillons utilisés23,24.
La traducti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent l’assistance technique de l’INSTALLATION d’imagerie INGM (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare “Romeo ed Enrica Invernizzi” (INGM), Milan, Italie), en particulier C. Cordiglieri, pour l’assistance lors des images 3D multicolor DNA FISH Achat. Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à B.B.: EPIGEN programme phare italien, Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon, subvention nr 18754) et Giovani Ricercatori, ministère italien de la Santé (GR-2011-02349383). Ce travail a été soutenu par la subvention suivante à F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, subvention nr 2018-0321).
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Anti-Digoxigenin 488 | DBA | DI7488 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| Biotin 11 d-UTP | Thermo Fisher Scientific | R0081 | |
| BSA (bovine serum albumine) | Sigma | A7030 | |
| Coverlsips | Marienfeld | 117500 | |
| CY3 d-UTP | GE Healthcare | PA53022 | |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D21490 | |
| Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes | Sigma | D7656 | |
| Dextran sulfate (powder) | Santa Cruz | sc-203917A | |
| Digoxigenin 11 d-UTP | Roche | 11093088910 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 21969-035 500mL | |
| DNA polymerase I | Thermo Fisher Scientific | 18010-017 | |
| DNase I | Sigma | AMPD1 | |
| dNTPs (C-G-A-T) | Euroclone | BL0423A/C/G | |
| EGF | Sigma | E9644.2MG | |
| Ethanol | Sigma | 02860-1L | |
| FBS Hyclone | Thermo Fisher Scientific | SH30109 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-25mL | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Glutammine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516-100mL | |
| Glycogen | Thermo Fisher Scientific | AM9510 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| Human Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279-001 | |
| Insulin Human | Sigma | I9278-5 mL | |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M) | Sigma | S2889 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-25G | |
| PBS (phosphate-buffered saline) | Sigma | P4417 | |
| Pennycillin/Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 15070-063 100mL | |
| Pepsin | Biorad | P6887 | |
| PhasePrep BAC DNA Kit | Sigma | NA0100-1KT | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | |
| PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific | K220001 | |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | |
| RNAse cocktail | Thermo Fisher Scientific | AM2288 | |
| Rubbercement | Bostik | ||
| Slides | VWR | 631-0114 | |
| Streptavidina Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | S21374 | |
| Tri-Sodium Citrate | Sigma | 1110379026 | |
| Tris-HCl | Sigma | T3253-500g | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250mL | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416-100mL |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
- van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
- Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
- Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
- Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
- Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
- Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
- Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
- Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
- Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
- Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
- de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
- Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
- Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
- Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
- Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
- Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
- Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
- Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
- Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
- Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
- Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
- Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
- Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
- Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
- Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
- Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).
