Summary

澄清和成像念珠菌生物

Published: March 06, 2020
doi:

Summary

为了查看和量化念珠菌生物膜的内部特征,我们制备了固定完整的标本,通过折射率匹配进行澄清。然后,利用光学切片显微镜通过生物膜全厚度获取三维图像数据。

Abstract

微生物真菌念珠菌性白化剂可以经历从合并殖民到毒性的变化,这与从酵母形式生长到海藻生长的能力密切相关。启动这一过程的细胞在表面和彼此上都粘附着,从而产生生物膜菌群的发展。这通常不仅发生在酵母感染的粘膜组织表面,而且发生在医学植入物(如导管)上。众所周知,生物膜细胞对抗真菌药物具有抗药性,从生物膜中脱落的细胞可导致危险的全身感染。生物膜的范围从严重半透明到不透明,由于折射异质性。因此,真菌生物膜很难通过光学显微镜进行研究。为了可视化内部结构、细胞和亚细胞特征,我们通过逐步溶剂交换来澄清固定完好的生物膜,以达到最佳折射率匹配点。对于C.白化生物膜,甲基水杨酸(n = 1.537)能够充分澄清,使共聚焦显微镜从顶点到600μm生物膜中,衰减甚微。在此可视化协议中,我们概述了相位对比度折射仪、实验室生物膜的生长、固定、染色、溶剂交换、共聚焦荧光显微镜的设置以及具有代表性的结果。

Introduction

念珠菌是一种微生物真菌,通常为人类提供等。生物学家对此有着根本的兴趣,因为生物体具有多种形态。例如,为了响应某些环境线索或压力,酵母状萌芽细胞将转向丝状生长,作为称为催眠的超细细胞的隔膜链。这种转变是重要的一个例子,表型表达单细胞和多细胞基因表达程序之间的转换。同样,C. 白化病菌也具有生物医学兴趣,因为生物体是一种众所周知的机会性病原体。它负责粘膜酵母感染,如鹅口疮(口腔念状病),泌尿生殖系统感染,以及免疫衰弱患者的危险侵入性或全身感染的原因。

这种有机体的毒性潜力与其多种形态和遗传多功能性1、2、3、4等方面有着密切的联系。细菌管延伸,向子宫生长过渡的第一个可见阶段,发生以足够的速度,使被吞没的C.白化病细胞爆发出噬菌体,从而逃脱宿主5细胞免疫反应的早期阶段。此外,丝丝出现之前,并伴随着细胞到细胞和细胞到表面的依从性大量增加,这是由于几种类细胞壁蛋白的调节表达,称为邻蛋白6,7,8,9。在各种条件下,依从和丝丝的结合导致从浮游、单细胞生长向形成生物膜的表面相关的殖民生长的戏剧性转变。C. 白化藻生物膜可能在常见的植入式医疗设备(如静脉导管)上开发。当这种生物膜开始从酵母状细胞中发芽并进入循环血液时,就会导致传播性感染。多项研究表明,生物膜细胞比木板细胞10、11更耐抗真菌药物,这在一定程度上可能是由于新陈代谢降低12。此外,生物膜的整体依从性高,可能为催眠菌有效侵入组织1提供锚定。

通过折射率匹配对C.藻类生物膜进行光学澄清,对我们可视化这种微生物群落结构并发现基因表达与表型关系的能力产生了重大影响。在48小时液体培养培养基下测试表面的实验室中生长的生物膜,表现为一种厚实和厚到足以不透明的白色涂层(图1)。因此,生物膜的许多有趣的画像特征都隐藏在视野中。生长于YPD、RPMI-1640或蜘蛛介质的24小时野生型生物膜,其厚度可达300μm,48小时生物膜通常达到500μm。不极性是由于光散射引起的,它产生于折射异质性:真菌细胞壁比周围的介质折射性高,细胞质比细胞壁折射略高。当用传统显微镜甚至共聚焦扫描仪(图2)观察时,原生生物膜产生的高光学密度使所有结构模糊了超过30μm的体积。然而,通过渗透具有高折射率液体的固定生物膜,与主要细胞成分的折射率大致匹配,可以实现很大程度的澄清。澄清后,亚微米分辨率成像可通过共聚焦显微镜通过几乎任何C.白化生物13的整个厚度进行。在野生型标本中,不难看出生物膜由长缠绕催眠、酵母状细胞团或伪海噬细胞、空隙和一定量的细胞外基质组成。此外,生物膜通常是分层的,显示细胞类型、细胞密度和萌芽或分支细胞存在的空间变异形态差异。在突变菌株14、15开发的生物膜中,观察到了其中一种或多种特征的许多变化。此外,记者还显示基因表达的原位空间差异16、9、13。这种相对简单且廉价的方法可获得的令人惊讶的澄清程度,也使得许多生物膜包括尖峰催眠和基底侵入性催眠,一直延伸到毫米的距离。

在此可视化协议中,我们演示了使用简单的细胞壁标记作为污渍的C. 白化生物膜的固定、标记、澄清和成像。本版本协议的起源是,当甲醛固定生物膜被渗透97%乙二醇二甲酰酸酯(GMA)时,我们观察到的清晰度提高了,然后聚合,将生物膜嵌入到具有中等高折射率(n = 1.49)的硬塑料中。然后,我们使用传统的相位对比显微镜和一系列折射率参考液体,更准确地确定生物膜的对比度反转点(最大透明度)(图3)。对于C.白化生物膜,这发生在接近n = 1.530,这是令人惊讶的高,因为密集的蛋白质结构,如角蛋白只是稍微折射(1.54×1.55)。虽然它位于图3中最佳范围的上端,但我们在现行协议中采用了甲基水杨酸(冬绿油,n = 1.537),因为它长期以来一直被用作胚胎学和组织学中显微镜的澄清剂,具有低毒性和低蒸汽压力,在利用中NA油浸没光学器件的试验中取得了优异的成绩。

这里应提出四点意见:

(1) 除少数例外情况外,显微镜的理想情况是,样品的折射率应等于客观透镜浸入液17、18、13的折射率。对于需要深度对焦的三维(3D)成像研究,这一点始终很重要。

(2) 我们用于最佳清除的实验结果(n = 1.525=1.535)略高于标准浸没油(n = 1.515,1.518),因此违反了点(1),因此在使用标准油浸没光学器件时引入了球形畸差源。此问题的一个解决方案是使用为较高范围内的浸入式指数设计的目标。由于对成像清除的标本的兴趣重新抬头,需要纠正的专业目标正在变得可用。另一种解决方案是,通过添加少量丁醇(n = 1.399),将澄清介质的指数调整到1.515或1.518,以实现最佳的油浸式性能,并接受稍微下降的清晰度。

(3) 完整生物膜(以及此比例的其他样品)的显微镜需要显著的工作距离,以适应试样厚度。这是一个重大的实际考虑。较长的工作距离将光学器件限制在中等数值孔径(NA = 0.6×1.25),这限制了分辨率,但也限制了球形畸变的严重程度。

(4) 其他类型的固定试样,用于澄清的最佳折射率可能不同。试样应使用相位对比度和一系列折射率参考液体进行相应测试,如图3所示。

Protocol

1. 生物膜文化的发展 注意:念珠菌性白化病是一种人类病原体。在一些机构,这种有机体的文化需要BSL-2的遏制。 在酵母提取物-肽-dextrose (YPD) a加板上取出选定的菌株,并在 30°C 下生长 48 h。 从板中选择单个菌落,在15 mL培养管中接种5 mL的YPD介质,在30°C下进行夜间有氧生长(旋转木马旋转器,52~55 rpm)。 使用隔夜培养的40至50倍稀释来确定细胞密度。计算硅底层细胞密度达到3 x 106细胞/mL所需的稀释系数,或用于用康帕纳瓦林-A(ConA)或小麦-细菌凝固素(WGA)处理的覆盖玻璃表面的0.6×1.2 x 106细胞/mL(见讨论)。 对于12孔板的生物膜生长(图1),将2.0mL无菌丝状介质分到每口井中,并在加湿培养箱中加热到37°C。各种介质将诱导丝丝化,在高温(37°C)和添加血清时更强烈。建议使用胎儿牛血清 (FBS)。推荐的介质是 YPD、蜘蛛曼尼托尔或 RPMI-1640。 使用无菌钳子,将准备好的底板放入加热板中的每个孔中,并去除气泡。从隔夜培养中加入接种,以达到步骤1.3中建议的细胞密度。一口没有井的井作为视觉空白和控制污染。 将板放在 60 rpm 轨道混合器上,在加湿的 37°C 空气培养箱中 90 分钟,以便有时间进行细胞粘附。90分钟后,取出中细胞和未连接细胞,用无菌介质或磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗,并将接种的亚地层放入培养皿或其他含有预暖丝状介质的多孔板中。对于多孔板,使用第二板进行洗涤步骤和第三个板非常方便,每口孔具有 2.0 mL 预热介质,以便接收被冲粉的分层。每次转移前消毒钳子。 将板返回到 37 °C 加湿环境空气培养箱,通过 60 rpm 轨道混合将生物膜长至 48 小时进行曝气。除非正在发育的生物膜脱落酵母状细胞,否则每种培养体中应该很少生长木板。以这种方式生长的生物膜如图1所示。 2. 用于成像的试样处理 注意事项:醛固定剂是挥发性和危险的。在烟雾罩中准备固定稀释剂,而不是在生物安全柜中。请勿将固定剂放入用于活细胞的培养箱中。在烟熏罩或通风良好的台面区域的带盖的菜肴中使用稀释的固定剂。将固定剂和修复后洗涤解决方案作为危险废物处理。 在 PBS 中制备新鲜固定性、4% 甲醛或甲醛,可选配高达 2% 谷醛。正式稀释至4%,可用于日常工作。注:谷醛尤其会增加宽带自荧光,并可能减弱可表达标签(如dTomato)的荧光。 从试样中取出培养基,用PBS稀释血清蛋白,或将其底层上的生物膜转移到PBS,几分钟。 将试样转移到固定,并将覆盖的盘放在慢轨混合器上 20 分钟。延长处理较厚试样时的时间段(参见讨论)。应为每个菜添加足够的固定体积,以浸没所有生物膜生长,包括盘内侧的任何生物膜生长。 取出固定物,用 PBS 重新填充盘子以洗掉残留固定物。将固定物作为危险废物处理。重复几次短期的解说,然后进行较长的补时,让残余固定物有时间从生物膜或agar块中扩散出来。洗涤期取决于允许固定的时间(请参阅讨论)。 所需的污渍量将取决于生物膜质量。在染色前,从培养皿的非试样区域取出所有生物膜,或在染色前将固定标本转移到新盘中。不要让生物膜排干或干燥。 使其浸入 PBS 中。 将污渍添加到盘子中(参见讨论),并在慢轨混合器上设置覆盖的盘子过夜(请参阅讨论)。防光。 早晨,取出染色溶液,用PBS重新填充盘子,以稀释未加束的污渍。将盘子放在慢轨混合器上,以脱色几个小时。 3. 澄清议定书:关于非渗透子底体的生物膜 澄清的生物膜很难在视觉上辨别。因此,如果需要,用划痕标记每个下层的一侧,以指定接种的一侧。 使用标有标签的长巴斯德移液器处理所有后续废物和溶剂转移,以避免溶剂交叉污染。 使用钳子,将固定生物膜从PBS转移到5mL的50:50 PBS:甲醇在20 mL玻璃瓶中,生物膜朝上。以1分钟间隔手动与轨道运动混合5分钟(参见讨论)。 将溶剂取出到废瓶中,小心避免移液器和生物膜或生物膜和小瓶之间的接触。用 3 mL 的整洁甲醇轻轻重新填充。以1分钟间隔与轨道运动手动混合3分钟。 将溶剂取出至废瓶中,并立即用5mL甲醇重新加注。以1分钟间隔与轨道运动手动混合5~10分钟。将溶剂取出废瓶,并立即用3 mL甲醇重新加注。生物膜在这一点上看起来往往比最初的外观更不透明。 将溶剂取出至废瓶中,立即用5mL50:50甲醇:甲基水杨酸重新填充小瓶。以1分钟间隔与轨道运动手动混合5~10分钟。这种混合溶剂中的生物膜应半透明。 将溶剂取出到废瓶中。用 3 mL 的整洁甲基水杨酸盐 (MS) 轻轻重新填充小瓶。以1分钟间隔与轨道运动手动混合3分钟。 将溶剂取出到废瓶中,并立即用 5 mL 的整洁 MS 重新填充。此时,生物膜应该是透明的。将溶剂取出到废瓶中,并立即用 3 mL 的整洁 MS 重新填充小瓶。加工的生物膜在此溶剂中稳定。 对于阿加上的生物膜(参见讨论)延长所有交换时间,允许水和溶剂通过agar扩散。必要的时间段可以使用带暗场照明的低功耗解剖显微镜进行估计,以观察溶剂向阿加推进。当使用 2% 的 agar 时,该协议可实现良好的澄清,并且没有重大收缩效应,但如果使用钳子处理时挤压,则澄清的 agar 会收缩。建议使用铲子。 4. 共聚焦显微镜成像设置 以下步骤用于使用倒置显微镜。使用具有盖玻璃底部的防溶剂盘将倒置的试样放在显微镜舞台上(请参阅讨论)。 准备垫垫,以支持倒置的试样。使用从显微镜幻灯片(1,000 μm 厚)、盖眼镜(170 μm)或 13 毫米硅胶环(330 μm,参见材料表)切割的小矩形,可根据需要堆叠。将环预浸在甲基水杨酸中 1 小时,以尽量减少因肿胀而导致的焦力漂移。 对于医疗级硅胶广场上的生物膜,反转正方形(即将其向下转动生物膜),并将其放在盘中甲基水杨酸池中的垫片上(图 2)。确保避免试样下方出现任何气泡。 将盘子牢固地安装在显微镜的舞台上,使油浸入式接触目标(参见讨论)。 调整盘中MS的量,使半月板通过表面张力将试样牢牢地固定在垫子上。将 MS 液滴放在倒置方形底层的顶部,以减少哑光表面的光散射,并用玻璃板盖住盘子以限制蒸发。在成像之前,等待几分钟,让试样安顿在垫子上。 使用透射光目视检查视野并定位相对于倒置生物膜的射标和基底区域的当前焦点位置。将冷凝器照明数字孔径 (INA) 设置为最小(关闭冷凝器光圈)以增加对比度,否则澄清的生物膜将几乎不可见。完成后,关闭传输的光源。 切换到共聚焦荧光,并设置跨生物膜所需的串行对焦图像堆栈的下限和上限。向上对焦驱动步进,这是推荐的,将首先显示脱落的细胞已经安顿在盖玻璃和非常长的尖峰海皮,休息在玻璃上。在序列的上端,应该看到创始人细胞附着在生物膜底部的底层。使用讨论中概述的一般条件设置针孔直径、图像平面中的像素间距和对焦步长增量。

Representative Results

如图1所示的生物膜具有高度半透明到不透明,但通常通过采用上述协议进行澄清和成像。图2显示了PBS固定生物膜中荧光与聚焦深度的强衰减,与指数匹配后的相同生物膜相比。如图3所示,使用连续的误用溶剂增加折射率,可以快速估计最大清晰度。这是通过传统的相位对比显微镜来精确改进的,以找到最小对比度点(最大透明度)。很明显,这种最佳性不是通过均匀的指数匹配来实现的。这是因为亚细胞结构在折射率上略有不同。在这种情况下,细胞壁发生对比逆转,溶剂指数略低于细胞质。对于念珠菌生物膜,最佳发生接近 n = 1.530。图4A中的48小时野生型和cak1 DX突变生物膜厚度为500μm,但基底的酵母细胞的成像速度几乎与甲虫细胞一样清晰。同样,如图4C所示,荧光衰减与焦点深度没有强相关。图5显示了在agar中侵入性催眠剂,在表面生物膜下面数百微米。成熟的侵入性催眠剂持续产生侧萌酵母近端到子宫链中的隔膜,产生酵母状细胞的亚群落,沿着侵入性催眠带定期。 图1:澄清前的生物膜培养。一种24小时生物膜,由补充efg1[/]菌株的分离物生长在12孔板上的硅方在RPMI-1640液体介质补充10S。无菌空白位于 C4 井中。 内衬显示96小时野生型生物膜的切割横截面生长在6孔板上,在3.75毫米的agar底座上,在同一介质上显示侵入性催眠。两个面板的比例相同。比例尺 = 2.0 mm。请点击这里查看此图形的较大版本。 图 2:通过索引匹配改进深度成像。下图显示了 48 小时野生生物膜共聚焦图像堆栈的侧视投影,该生物膜固定并沾染了 ConA-Alexafluor 594。(A) 该标本使用 63x 1.0 NA 直接浸水目标在 PBS 中成像。在30μm的聚焦深度下,衰减很严重。(B) 经协议步骤 3.3_3.8 澄清后,使用 40x 0.85 NA 油浸没目标,以最小的衰减在甲基水杨酸中成像相同的生物膜。在 3D 图像堆栈的背景减法和侧视投影后,对 40x 数据进行了空间调整,以匹配 63x 数据进行比较。(C) 示意图显示通过以带水泥盖玻璃底部的黑色阳极氧化铝盘转移到 MS 的清除试样(从 MS)倒置安装(参见讨论)。刻度柱 = 50 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。 图3:相位对比度折射测量显示细胞特征在最佳指数匹配范围内的对比度反转。盖眼镜上的固定生物膜从PBS交换成甲醇,然后交换成二甲苯(n = 1.496)。然后,这些生物膜从二甲苯交换成一组折射率参考液体(E系列,嘉吉实验室,见材料表),并并排目视检查以确定具有最高透明度的指数范围。(上面板)相位对比图像:一个生物膜在二甲苯和一组狭窄的参考液体之间连续交换。每次交换后,使用 40x 0.85 NA Ph2 油浸没相对比度目标和 Ph2 冷凝器,对同一场油田进行重新定位和查看。所有图像都使用相同的灯设置和摄像机曝光进行记录,以准确显示变化。随着指数的增加,首先在细胞壁的n = 1.530处出现对比度反转,然后是细胞质在n = 1.535。刻度柱 = 10 μm。(下面板)在最大透明度点显示平均生物膜亮度的最小值的图形。生物膜内光的强散射导致平均亮度超过空白场。隔离单元格看起来比空白字段暗,在范围 1.530~1.535 中出现对比度反转。请点击此处查看此图形的较大版本。 图4:突变和野生C型藻类生物膜的深层成像。野生型菌株(DAY185)和细胞循环相关蛋白激酶减少表达菌株(cak1 DX)14生长在37°C,在48小时在液体YPD介质的硅胶亚底。生物膜固定,沾染ConA-Alexafluor 594,并使用溶剂交换协议澄清为甲基水杨酸盐。三维共聚焦显微镜显示,两种生物膜厚度为±500μm。图像数据在 ImageJ 或斐济(https://imagej.nih.gov/ij/ 或 http://fiji.sc)中转换为 32 位格式,然后使用具有 50 像素滚动球半径的”减法背景”函数进行处理,阈值设置为将负像素设置为零,重新切片,并使用最大强度投影生成侧视图。(A) 轴向和侧视投影:野生型生物膜的厚度增长到 502 μm,如 558 平面共聚焦图像堆栈的侧视图投影所示。刻度柱 = 100 μm。(左侧面板)从顶点(顶部)到底座(底部)的 40 平面轴向投影显示生物膜不同地层中细胞类型的变化。此示例显示了典型的野生类型结构:基底的粘附细胞产生催眠,并上升到伪海藻和酵母状细胞的密集中间区域。在中区上方,催眠再次出现,并产生了萌芽酵母集群。在尖峰区看到的长催眠剂可能延伸到活生物膜中的培养介质,但在试样处理过程中折叠到生物膜表面。cak1 DX 生物膜的厚度增长到 500 μm,如 556 平面图像堆栈的侧视图投影所示。这个突变体,已知在缺乏诱导应力的情况下经历丝状生长14,产生了一个截然不同的建筑。如侧视和轴向投影(右手面板)所示,许多分支细胞都产生了径向外生长。(B)在 cak1 DX 生物膜中分枝催眠的示例。刻度柱 = 10 μm。(C) 澄清的野生型生物膜中深度的荧光衰减通过遮蔽背景像素进行量化,然后计算每个图像平面中所有非背景像素的平均数字信号。除了由力克蛋白标记的尖酸海皮外,没有具有聚焦深度的强衰减趋势。请点击此处查看此图形的较大版本。 图5:表面生物膜中agar.C.白化藻中的侵入性催眠剂将穿透agar底至毫米的距离(见图1)。澄清后,通过生物膜向下查看侵入性结构,或从阿加的底部向上查看。后者要求更大的工作距离。或者,固定后,但在染色和溶剂交换之前,安格可以用手术刀或剃刀刀片垂直切割成1⁄2毫米板,然后可以打开一侧,并在染色和澄清后直接在侧视图中成像。建议执行此过程。在 213 μm 方形视野的投影中,使用了彩虹色刻度在 75 μm 范围内编码轴向位置:蓝色要素靠近,红色要素更深于页面平面。这一观点表明,长催眠芽以半常间隔关闭侧酵母状细胞,导致亚菌群。刻度柱 = 50 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。

Discussion

荧光显微镜在光学切片、分辨率、速度、避免或补偿畸变、多通道采集和计算能力方面的进步,使成像完整标本重新出现。对于固定标本,古典和新颖的澄清和扩展方法都产生了重大影响19,20,21,22,23,24。在这种情况下,我们应用了一种快速而简单的溶剂基指数匹配方法,以研究具有严重半透明性到不透明的真菌生物膜的结构。

前面的协议已经用一系列试样进行了测试。在我们的实验室中,念珠菌生物膜通常生长在14毫米的正方形上,从医疗级硅橡胶片中切割(参见材料表)。之所以使用这种下层,是因为浸于液体培养基中的PDMS(聚二甲基硅氧烷)的生长被确定为与医疗植入物相关的感染的重要体外模型,特别是浸入导管。启动丝丝的应力细胞会迅速附着在非极性表面,如PDMS。实际上,在高压灭菌器(干循环)中清洗和重新加工的所用方块为任何特定菌株提供最一致的生物膜。生物膜也通常种植在盖眼镜,盖玻璃底培养皿,在标准细菌级聚苯乙烯菜肴,和阿加。由于C.白化糖细胞不能很好地粘附在玻璃上,盖眼镜应该用一种将细胞壁多糖结合的支体进行治疗。我们在无菌水中将40μL的1mg/mL ConA或WGA涂到每个盖玻片表面。干燥后,盖眼镜用40μL的1%谷氨酸处理3分钟,将蛋白质交叉到不溶性薄膜中。然后用无菌蒸馏水清洗,以去除固定和任何可溶性的克丁和风干。如有必要,经过处理的盖眼镜或洗碗在杀菌紫外线灯下冷藏10分钟。

试样厚度将影响协议中所需的孵育期。固定扩散到300μm生物膜需要几分钟才能平衡。此时间段会随着试样厚度的平方增加而增加,对于厚度极厚的生物膜或厚度为 2⁄3 mm 的 agar 块试样,应延长到一小时或更长时间。染色的均衡时间也取决于用于固定和冲洗的试样厚度。然而,由于支气口扩散速度比低MW固定剂慢,特别是在加胶凝胶内,染色应延长一夜。冲洗多余的污渍时也应这样做。

各种类型的污渍可以纳入协议。我们使用细胞壁污渍进行结构成像,最常见的是Calcofluor白M2R(氟。增亮剂#28)或染料标记的力克剂,如ConA-Alexafluor 594或WGA-Alexafluor 594。应注意蛋白质的含量。ConA 四面体可能导致在生物膜的尖峰区域中导致高度柔性催眠的交联。这在 WGA 二分器中不太明显。这些标记物的规范特性是甲酸钙素的钙氟醇、曼鼻残留物的ConA和用于N-乙酰-D-葡萄糖胺和胆酸残留物的WGA。

由于溶剂交换协议从PBS或水通过甲醇分级成甲基水杨酸,试样容器必须耐溶剂。甲基水杨酸盐 (MS) 可快速软化聚苯乙烯塑料制品,并缓慢软化其他塑料。协议步骤到使用整齐的甲醇可以在塑料制品中进行,但在协议中,我们一般切换到标准的20 mL玻璃闪烁瓶与防溶剂螺丝帽。小瓶对于硅胶方形亚地层上的生物膜来说很方便,因为方块可以用细钳子拾取和转移。此外,小瓶可以排空,用平方形在内曲面上重新填充,使生物膜不接触玻璃。底层应是生物膜,当它浸入直立小瓶。小瓶非常适合长期标本储存。

在澄清协议中,更分级的溶剂交换步骤将样品变形的风险降至最低,因为溶剂混合效果。为了在基本协议中速度和方便,有四个步骤:1)步骤3.3,PBS到50:50PBS:甲醇;2)步骤3.4和3.5,PBS:甲醇到整洁甲醇,3)步骤3.6,整洁甲醇至50:50甲醇:MS;和4)步骤3.7和3.8,甲醇:MS整洁MS甲醇提供过渡误区。然而,由于水和MS几乎不可理解,因此,在引入任何MS之前,所有水都必须被甲醇取代。 同样,由于甲醇挥发性极高,因此必须用MS取代所有甲醇。残余甲醇的蒸发会导致试样内的折射率变化。在四个步骤序列中,建议通过添加另一个整齐的溶剂,甚至第三个变化来重复第二步和第四步。对于特别脆弱的标本,溶剂变化可以以较小的百分比步骤进行配制。

使用 a加块试样,步骤 3.4 和 3.5(正用甲醇)可能会导致在 agar 内出现盐晶体,因为甲醇中残留的 PBS 盐不溶性。在水:甲醇交换过程中,在第一个混合溶剂步骤中使用蒸馏水 (DW) 代替 PBS 稀释盐,可以避免这种情况。固定生物膜的替代溶剂交换序列包括以下步骤:1) 步骤 3.3,将试样从 PBS 转移到 50:50 DW:甲醇(允许额外的时间通过 agar 扩散);2) 步骤 3.4,将试样从 50:50 DW:甲醇转移到整洁的甲醇中(重复 2 倍,与步骤 3.5 中的甲醇一起重复);3)步骤3.6,将试样从甲醇转移到50:50甲醇:甲基水杨酸盐;和 4) 步骤 3.7,将试样从 50:50 甲醇转移到整洁的 MS(与 MS 重复 2 倍,如步骤 3.8 所示)。

由于甲基水杨酸会迅速软化聚苯乙烯塑料制品,我们使用带盖玻璃底的阳极氧化铝盘将澄清的生物膜放在倒置显微镜的舞台上。盖玻璃采用UV固化光学水泥(诺兰光学粘合#61,参见材料表)。如果MS在一天结束时被去除,用异丙醇清洗盘子,然后用肥皂水和冲洗,水泥盖玻璃将服务数月。

由于最小化球形畸变的重要性和足够的工作距离,客观透镜选择在澄清标本的大规模成像中至关重要。在这些研究中,我们有三个目标的经验。在倒置显微镜设置中,我们使用长时间工作距离、中等数值孔径 (NA) 目标油浸没在盖玻璃下方,生物膜浸入覆盖玻璃上方的盘中甲基水杨酸盐中。我们的大部分工作都完成了蔡司环球系列非色目标,类型461708,40x 0.85NA Oel 160/1.5,与负160毫米焦距适配器一起使用,用于名义无限偶联(IC)兼容性。这个目标最初设计用于通过1.5毫米显微镜幻灯片,工作距离为0.35毫米的浸没式观察25。当与标准盖玻璃(0.17 mm)一起使用时,工作距离要大得多:1.5 × 0.35×0.17 = 1.68 mm = 1,680 μm。我们还使用新的蔡司多浸没目标,类型为 420852,25x 0.8NA LD LCI 平面图-同色,工作距离超过 540 μm,浸入校正设置为”油”的高侧。这一目标被高度纠正,并产生一个极好的形象。在直立显微镜支架上,我们使用新的尼康多浸没目标,类型 MRD71120,10x 0.5NA CFI 平面-色谱,工作距离超过 5,000 μm (5 mm),浸入校正设置为”油”的高端(n = 1.518)。虽然这一目标具有低于其他目标的NA,但它具有直接浸入甲基水杨酸盐的优点。

为了在速度和分辨率方面优化数据采集,共聚焦显微镜设置最好应同时满足横向和轴向奈奎斯特采样密度18。使用传统标准,将共聚焦针孔直径名义上设置为 1 气孔单元。在放大的坐标中,

dP (μm) = 1.22 x 放大倍数 x (发射波长以 μm 为单位) / NA

横向采样(像素间距)不应超过 (1/2) x Abbe 的分辨率限制。在对象空间坐标中,

[x, μy = (发射波长以 nm) / (4 NA)

轴向采样(对焦增量)不应超过逆轴向带宽,

[z = (浸入指数) x (发射波长以 nm) / (NA2

共聚焦光学系统将显微镜的带宽扩大,并将横向和轴向分辨率锐化至少 1/⁄2。

对于我们最常使用的 40x 0.85 NA 目标,请参阅表 1了解 600 nm 发射波长的这些公式的结果(Alexa Fluor 594)。

公式 x 1/±2 套装(典型)
dP (μm) 34.5 μm 25 或 50 μm
±x, _y 176 纳米 125 纳米 161 纳米
*z 1200 纳米 848 纳米 900 纳米

表 1:600 nm 发射波长的共聚焦针孔直径、横向采样和轴向采样值。

使用具有这些设置的旋转磁盘共聚焦扫描仪和 1,392 x 1,040 像素扫描场,可以以合理的速度和分辨率获取来自生物膜标本的数据。典型的单色 3D 图像堆栈运行 0.35*1.55 GB。

澄清介质在广泛使用中跨越了显著的折射率范围。通过暗场照明和目视检查,我们发现固定的C.白化生物膜在n = 1.5上方最透明。通过相位对比显微镜将此细化为 n = 1.530=1.535。出于许多实际原因,我们使用甲基水杨酸盐(n = 1.537)作为最终指数匹配溶剂。虽然溶剂交换会带来试样变形或其他伪影的风险,但固定、澄清的试样中的细胞具有与活试样相似的细胞体尺寸、海噬膜直径和隔膜长度尺寸。

溶剂交换过程中的许多变化是可能的(例如,使用不同的过渡溶剂或不同的最终溶剂)。甲醇因其高极性和快速扩散性而被选中,但乙醇已被证明能更好地保存红色荧光蛋白(RFP)量子产量26作为过渡溶剂。甲基水杨酸盐的指数、中极性、低蒸汽压力以及与许多污渍、染料和荧光蛋白的相容性被选中。然而,指数稍低的最终溶剂,或甲基水杨酸和较低指数溶剂(如丁醇)的混合物,可能效果更好。

出乎意料的是,通过生物膜看出其分层的内部特征的能力,也有助于查看扩展结构的起源,如长,未纠缠的尖峰催眠和侵入性基底海藻在某些子地层。C. 藻化剂中的机会性毒性取决于其遗传多功能性(即,向子宫生长转换、细胞底质和细胞粘附性提高、细胞萌芽和伸长生成渗透物以及使用替代营养素)。海噬性扩展使单个C.白化病细胞从噬菌体免疫细胞中分离,但也是入侵所必需的。生物膜附着力和子宫纠缠似乎提供了催眠剂有效侵入地层所需的表面锚定。当该底层为宿主组织时,可能导致毒性增加。

成像完整的生物膜能够利用记者菌株进行基因表达、模型组织亚地层以及包括天然生物膜中发现的细菌等其他生物体,进行大量信息性实验。即使在最简单的纯结构成像与细胞壁染色的情况下,原位表型被揭示,然后可以量化和基因分析。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究部分得到了NIH授予R01 AI067703,R21 AI100270,R21 AI135178给A.P.米切尔的支持。作者感谢格林菲尔德’Kip’Sluder提供了在这项工作中使用的远程油浸式目标,并感谢丹尼尔·希瓦尔斯基与直接甲基水杨酸盐浸泡共聚焦显微镜。

Materials

Biohazardous waste receptacle
Biosafety cabinet with germicidal UV lamp
Calcofluor White M2R (2.5 mg/mL in methanol)
Concanavalin A – Alexafluor-594 or other conjugate
Distilled water DW
Distilled water, sterile
Ethanol, absolute EtOH
Fetal bovine serum (FBS), sterile
Fixative waste bottle in secondary containment
Formaldehyde 20% in water, ampules Electron Microscopy Sciences
Formaldehyde alternatives: paraformaldehyde powder, formalin 37% Electron Microscopy Sciences
Fume hood
Glutaraldehyde 25% in water, ampules Electron Microscopy Sciences
Incubator – 30 deg C, with rotary mixer (60 rpm) for culture tubes
Incubator – 37 deg C, with orbital mixer for culture plates
Isopropanol 70% iPrOH 70%
Longwave (365 nm) UV lamp, 5Watt Cole-Parmer Scientific for curing NOA-61 cement
Medical grade silicone sheet, 0.060" (1.52 mm) thick Bentec Medical, Inc., http://bentecmed.com/ Non-reinforced medical grade silicone sheeting
Methanol 99.9% MeOH
Methyl salicylate 99% MS
Millipore Swinnex 13mm white silicone ring gaskets Millipore Corp. SX0001301
Norland UV-curing optical adhesive – type NOA-61 Edmund Optics, Inc., https://www.edmundoptics.com NOA-61
Orbital mixer, benchtop
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile
Refractive index standard liquids, n=1.500 to 1.640 (29 liquids, 0.005 increment) Cargille Laboratories, https://cargille.com Series E Cedar Grove, NJ 07009, USA
RPMI-1640 base medium, HEPES buffered, sterile
Scintillation vials, 20 mL – Wheaton, Urea cap PE cone cap liner Fisher Scientific Co. 03-341-25H for specimen processing and storage
Solvent waste bottle in secondary containment
Spider medium with mannitol, sterile (1% Difco nutrient broth, 0.2% K2HPO4, 1% D-Mannitol)
Wheat germ agglutinin – Alexafluor-594 or other conjugate
Yeast-peptone-dextrose (YPD) agar plates, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)
YPD medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)

References

  1. Desai, J. V., et al. Coordination of Candida albicans invasion and infection functions by phosphoglycerol phosphatase Rh2. Pathogens. 4, 573-589 (2015).
  2. Miramón, P., Lorenz, M. C. A feast for Candida: Metabolic plasticity confers an edge for virulence. PLoS Pathogens. 13 (2), 1006144 (2017).
  3. Bonhomme, J., et al. Contribution of the glycolytic flux and hypoxia adaptation to efficient biofilm formation by Candida albicans. Molecular Microbiology. 80, 995-1013 (2011).
  4. Ramírez-Zavala, B., et al. The Snf1-activating kinase Sak1 is a key regulator of metabolic adaptation and in vivo fitness of Candida albicans. Molecular Microbiology. 104, 989-1007 (2017).
  5. Westman, J., Moran, G., Mogavero, S., Hube, B., Grinstein, S. Candida albicans hyphal expansion causes phagosomal membrane damage and luminal alkalinization. mBio. 9, 01226 (2018).
  6. Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9, 109-118 (2011).
  7. Finkel, J. S., et al. Portrait of Candida albicans adherence regulators. PLoS Pathogens. 8, 1002525 (2012).
  8. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic Cell. 12, 470-481 (2013).
  9. Lagree, K., Mitchell, A. P. Fungal Biofilms: Inside Out. Microbiology Spectrum. 5, (2017).
  10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39, 2128-2131 (1995).
  11. Chandra, J., et al. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  12. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50, 3839-3846 (2006).
  13. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  14. Woolford, C. A., et al. Bypass of Candida albicans filamentation/biofilm regulators though diminished expression of protein kinase Cak1. PLoS Genetics. 12, 1006487 (2016).
  15. Huang, M. Y., Woolford, C. A., May, G., McManus, C. J., Mitchell, A. P. Circuit diversification in a biofilm regulatory network. PLoS Pathogens. 15 (5), 1007787 (2019).
  16. Ganguly, S., et al. Zap1 control of cell-cell signaling in Candida albicans biofilms. Eukaryotic Cell. 10, 1448-1454 (2011).
  17. Frisken, G. S., Lanni, F. Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy. Journal of the Optical Society of America. 8, 1601-1613 (1991).
  18. Lanni, F., Keller, H. E., Yuste, R. M. Microscope principles and optical systems. Imaging, A Laboratory Manual. , 1-55 (2011).
  19. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  20. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
  21. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  22. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347, 543-548 (2015).
  23. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35, 757-764 (2017).
  24. Gao, R., et al. Cortical column and whole brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363, (2019).
  25. Carl Zeiss. Optical Systems for the Microscope publication 41-101-e. Carl Zeiss. , 48 (1971).
  26. Oldham, M., Sakhalkar, H., Oliver, T., Johnson, G. A., Dewhirst, M. Optical clearing of unsectioned specimens for three-dimensional imaging via optical transmission and emission tomography. Journal of Biomedical Optics. 13 (2), 021113 (2008).

Play Video

Cite This Article
Lanni, F., Lagree, K., Huang, M. Y., Yan, L., Woolford, C. A., Mitchell, A. P. Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms. J. Vis. Exp. (157), e60718, doi:10.3791/60718 (2020).

View Video