Анализ опухоли и распределения тканей целевого антигена специфических терапевтических антител
Summary
Здесь мы представляем протокол для изучения виво локализации антител у мышей опухоли ксенотрансплантата моделей.
Abstract
Моноклональные антитела являются высокой сродством многофункциональных препаратов, которые работают с переменными независимыми механизмами для устранения раковых клеток. За последние несколько десятилетий наиболее перспективной областью основных и терапевтических исследований стала область конъюгированных антител антител, бисспецифических антител, химерных антигенных рецепторов (ЦАР) и иммунотерапии рака. С многочисленными успешными испытаниями на людях, направленных на иммунные рецепторы контрольно-пропускных мишеней и CAR-T клеток при лейкемии и меланоме в прорывном темпе, это очень захватывающие времена для онкологических терапевтических средств, полученных из вариаций антител инженерии. К сожалению, значительно большое количество антител и CAR основе терапии также оказались разочаровывающими в человеческих испытаний твердых раковых заболеваний из-за ограниченной доступности иммунных клеток-эффекторов в опухолевой постели. Важно отметить, что неспецифическое распределение терапевтических антител в тканях, помимо опухолей, также способствует отсутствию клинической эффективности, связанной с этим токсичности и клинической недостаточности. Поскольку верный перевод доклинических исследований в клинические тропы человека в значительной степени зависит от ксенотрансплантата мышей эффективности и безопасности исследований, здесь мы подчеркиваем метод для проверки опухоли и общего распределения тканей терапевтических антител. Это достигается путем маркировки белка-очищенные антитела с вблизи инфракрасного флуоресцентного красителя следуют живые изображения опухолевых мышей подшипника.
Introduction
FDA одобрило первый моноклональный антитела ориентации CD3 (OKT3, Muromonab) в 1986году 1,2. С тех пор в течение следующих двадцати лет, произошел быстрый взрыв в области инженерии антител из-за подавляющего успеха антител против ингибиторов иммунной контрольной точки3. Помимо косвенной активации иммунной системы, антитела в настоящее время направлены непосредственно флаг раковых клеток точно заниматься иммунных клеток эффектора, вызвать цитотоксиситу через агонист рецепторов смерти, блок выживания опухолевых клеток сигнализации, препятствовать ангиогенеза (рост кровеносных сосудов), ограничить иммунные регуляторы контрольно-пропускных псов, доставить радиоизотопы, химиотерапевтические препараты и siRNAв качестве спряженных агентов 2. Кроме того, изучение одной цепи переменных фрагментов (scFv) различных антител на поверхности пациента производных Т-клеток и НК-клеток (CAR-T и CAR-NK) является быстро растущей областью клинических исследований для клеточнойтерапии 4.
Сверхвысокое сродство препаратов на основе антител, которые обеспечивают избирательность к антигену, выражаюму опухолевые клетки, делает его привлекательным агентом. Аналогичным образом, целевая доставка и удержание опухоли терапевтического антитела (или химического препарата) является ключом к балансу эффективности над токсичностью. Таким образом, большое количество белков инженерных стратегий, которые включают, но неограничиваются бисспецифических 5 и трехспецифическихантител 6 в настоящее время используются для значительного повышения алчность оптимизированной опухоли удержания внутривенно (IV)вводили терапии 5,7. Здесь мы описываем простой метод на основе флуоресценции для решения опухоли и распределения тканей потенциально эффективных противоораком антител.
Поскольку ткани животных обладают автоматической флуоресценцией при возбуждении в видимом спектре, антитела были первоначально помечены вблизи инфракрасного красителя (например, IRDye 800CW). Для доказательства концептуальных исследований, мы использовали фолиевой рецептор альфа-1 (FOLR1) ориентации антитела называется farletuzumab и его производные называется Бисспецифический якорь Цитотоксичность активатор (BaCa)7 антитела, которые совместно цели FOLR1 и смерти рецептор-5 (DR5)8 в одном рекомбинантных антител. FOLR1 является четко определенным переэкспрессом целевого рецептора в раковых клетках яичников и TNBC, опухолевых ксенотрансплантатах и опухоляхпациентов 9. Примечательно, что Есть несколько усилий, чтобы клинически использовать FOLR1 с использованием антител на основе подходов для привлечения иммунных клеток эффектора и антител наркотиков конъюгации (ADC) для рака яичникови молочной железы 10,11.
В этой работе методов, мы клонировали, выразили и очищены клинические анти-FOLR1 (farletuzumab) наряду с другими антителами контроля с помощью системы выражения CHO. Isotype IgG1 и клиническое anti-idiotype mucin-16 антитело вызванное abagovomab12 были использованы как отрицательные управления. После очистки белка-А, указанные антитела были помечены IRDye 800CW и вводились в хвостовую вену обнаженных мышей либо подшипников опухоли яичников ксенотрансплантатов или ножом трансфицированных человека FOLR1 выражая мурин рака толстой кишки ксенотрансплантатов. Локализация антител отслеживалась живой визуализацией с использованием спектра визуализации in vivo в нескольких разных точкахвремени 7. Этот метод не требует каких-либо генетических модификаций или инъекций субстрата для обеспечения легкого излучения и значительно быстрее, рентабельнее и эффективнее. Общий протокол клонирования, экспрессии, очистки и маркировки, описанный ниже, может применяться к любым клиническим и неклиническим антителам, если имеются тяжелые и легкие цепные последовательности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Селективная и опухолевая ткань специфической доставки противооопухольной терапевтического агента является ключом к измерению эффективности и безопасности данной целевойтерапии 13. Здесь мы описали быстрый и эффективный подход к исследованию детального распределения т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Университету Вирджинии онкологический центр Core Imaging фонда, биомолекулярного анализа фонда, Расширенный микроскопии фонда и основной Виварий фонда для оказания помощи. J. T-S является ранней карьеры следователя Академии рака яичников (OCA-DoD). Эта работа была поддержана грантом NCI/NIH (R01CA2333752) J. T-S, Программой исследований рака молочной железы (BCRP) прорывной премии уровня-1 J. T-S (BC17097) и премией США по исследованию рака яичников (OCRP) (OCRP) J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
