ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה vivo של נוגדנים בעכברים גידול xenograft מודלים.
Abstract
נוגדנים חד-קלונליים הם תרופות רב-תכליתיות עם זיקה גבוהה שעובדות על ידי מנגנונים עצמאיים משתנים כדי לחסל תאים סרטניים. במהלך העשורים האחרונים, התחום של נוגדנים-סמים התווסדו, נוגדנים דו-ספציפיים, קולטני אנטיגן כימריים (CAR) ואימונותרפיה סרטן התגלה כתחום המבטיח ביותר של חקירות בסיסיות וטיפוליות. עם ניסויים בבני אדם מוצלחים רבים המתמקדים קולטני מחסום חיסוני ותאי CAR-T בלוקמיה ומלנומה בקצב פורץ דרך, זה זמנים מרגשים מאוד עבור טיפולי אונקולוגיים נגזר וריאציות של הנדסת נוגדנים. למרבה הצער, מספר גדול באופן משמעותי של נוגדנים וטיפולים מבוססי רכב הוכיחו גם מאכזב בניסויים בבני אדם של סרטן מוצק בגלל הזמינות המוגבלת של תאי השפעה חיסונית במיטת הגידול. חשוב לציין, הפצה לא ספציפית של נוגדנים טיפוליים ברקמות אחרות מאשר גידולים גם לתרום לחוסר יעילות קלינית, רעילות הקשורים וכשל קליני. כמו תרגום נאמן של מחקרים פרה-קליניים לתוך שבילים קליניים אנושיים הם מאוד להסתמך על עכברים גידול xenograft יעילות ובטיחות מחקרים, כאן אנו מדגישים שיטה כדי לבדוק את הגידול ואת התפלגות רקמות כללית של נוגדנים טיפוליים. זה מושגת על ידי תיוג נוגדן מטוהר חלבון-A עם צבע פלורסנט אינפרא אדום ליד ואחריו הדמיה חיה של עכברים נושאים גידול.
Introduction
ה-FDA אישר את הנוגדן המונוקלונלי הראשון מיקוד CD3 (OKT3, Muromonab) בשנת 19861,2. מאז, בעשרים השנים הבאות, היה פיצוץ מהיר בתחום הנדסת נוגדנים בשל ההצלחה המוחצת של נוגדנים נגד מעכבי מחסום חיסוני3. לצד הפעלה עקיפה של המערכת החיסונית, נוגדנים נועדו ישירות לסמן תאים סרטניים כדי לעסוק במדויק בתאי השפעה חיסונית, לעורר cytotoxicity באמצעות אגוניסט קולטן מוות, לחסום איתות הישרדות תאים סרטניים, לחסום אנגיוגנזה (צמיחה של כלי דם), להגביל את הרגולטורים מחסום חיסוני, לספק radioisotopes, תרופות כימותרפיות siRNAכסוכנים בהסכם 2. בנוסף, לימוד שברי משתנה שרשרת יחיד (scFv) של נוגדנים שונים על פני השטח של המטופל נגזר T-תאים ותאי NK (CAR-T ו CAR-NK) הוא אזור גדל במהירות של חקירות קליניות לטיפולים מבוססי תאים4.
הזיקה הגבוהה במיוחד של תרופות מבוססות נוגדנים המספקת תסנות אנטיגן המביעה תאים סרטניים הופכת אותו לסוכן אטרקטיבי. כמו כן, משלוח ממוקד ושמירה על גידול של נוגדן טיפולי (או תרופה כימית) הוא המפתח לאיזון יעילות על רעילות. לכן, מספר גדול של אסטרטגיות מבוססות הנדסת חלבון הכוללות אך אינן מוגבלות bispecific5 ונוגדנים tri-ספציפיים6 מנוצלים כדי לשפר באופן משמעותי את השמירה גידול אופטימיזציה של תוך ורידי (IV) מוזרקטיפולית 5,7. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה מבוססת פלואורסץ כדי לטפל בהתפלגות הגידול והרקמות של נוגדנים אנטי סרטניים יעילים פוטנציאליים.
מכיוון שלרקמות בעלי חיים יש פלואורסצנטיות אוטומטית כאשר הן מתרגשות בספקטרום הנראה לעין, הנוגדנים סומנו בתחילה עם צבע אינפרא אדום ליד (לדוגמה, IRDye 800CW). להוכחת חקירות קונספט, עשינו שימוש קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) מיקוד נוגדן בשם farletuzumab ונגזרתו בשם מפעיל ציטוקסיה עוגן Bispecific (BaCa)7 נוגדן כי מטרות שותפות FOLR1 קולטן מוות-5 (DR5)8 נוגדן רקומביננטי אחד. FOLR1 הוא קולטן יעד מוגדר היטב במטגן יתר בתאים סרטניים בשחלות ו-TNBC, גידול xenografts ותגידוליםהחולה 9. במיוחד, ישנם מאמצים מרובים לנצל קלינית FOLR1 באמצעות גישות מבוססות נוגדנים לעסוק בתאי השפעה חיסונית ותרופת נוגדנים להציות (ADC) לסרטן השחלותוהשד 10,11.
בשיטות אלה נייר, שיכפלנו, ביטאנו ומטוהרים קליני אנטי FOLR1 (farletuzumab) יחד עם נוגדנים שליטה אחרים באמצעות מערכת ביטוי CHO. IgG1 isotype ונוגדן קליני נגד אידיוטי mucin-16 בשם abagovomab12 שימשו כפקדים שליליים. בעקבות טיהור חלבון-A, נוגדנים מסומנים סומנו עם IRDye 800CW וננתן לתוך ויריד הזנב של עכברים עירומים או נושאות xenografts גידול בשחלות או FOLR1 אנושי transfected באופן יציב המביע סרטן המעי הגס murine קסנוגרפטים. ההתקמה הנוגדן היה במעקב על ידי הדמיה חיה באמצעות ספקטרום הדמיה vivo במספר נקודות זמן שונות7. שיטה זו אינה דורשת כל שינוי גנטי או הזרקה של הצוללת כדי לאפשר פליטת אור והוא מהיר יותר באופן משמעותי, חסכוני ויעיל. פרוטוקול השיבוט, הביטוי, הטיהור והתיוג הכללי המתואר להלן יכול להיות מיושם על כל נוגדן קליני ולא קליני אם רצפי שרשרת כבדים וקלים זמינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
משלוח סלקטיבי ותו לא רקמות גידול ספציפי של סוכן טיפולי נגד סרטן הוא המפתח למדיטת יעילות ובטיחות של טיפול ממוקד נתון13. כאן תיארנו גישה מהירה ויעילה לחקור את התפלגות רקמות וגידול מפורט של קליני, farletuzumab ונוגדן BaCa לא קליני. הגישה המתוארת ישימה לכל נוגדן חדש שנוצר וניתן להשתמש בה ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה אוניברסיטת וירג’יניה סרטן מרכז הליבה הדמיה מתקן, מתקן ניתוח ביומולקולרי, מתקן מיקרוסקופ מתקדם ומתקן הליבה Vivarium לסיוע. J. T-S הוא חוקר קריירה מוקדמת של האקדמיה לסרטן השחלות (OCA-DoD). עבודה זו נתמכה על ידי מענק NCI/NIH (R01CA233752) ל J. T-S, ארה”ב. משרד העבודה סרטן השד תוכנית לחקר סרטן השד (BCRP) פריצת דרך ברמה 1 פרס J. T-S (BC17097) ו U.S. משרד העבודה סרטן סרטן התוכנית לחקר (OCRP) פרס מימון (OC180412) כדי J.
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
