ホワイトフライ組織におけるベゴモウイルスの免疫蛍光および定量PCRによる局在化と定量化
Summary
昆虫組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のための免疫蛍光法および定量PCR法について述べている。免疫蛍光プロトコルは、ウイルスタンパク質とベクタータンパク質を共局化するために使用することができる。定量PCRプロトコルを拡張して、ホワイトフライ体全体やウイルス感染植物のウイルスを定量化することができます。
Abstract
ベゴモウイルス(属ベゴモウイルス、ファミリーゲミニビリダ)は、ベミシアタバチ複合体の白飛によって永続的な循環的な方法で伝染する。世界中で生産されるベゴモウイルスによる大規模な被害を考慮すると、ベゴモウイルスとそのホワイトフライベクターとの相互作用を理解することが不可欠です。そのためには、ベクター組織におけるウイルスの局在化および定量化が重要である。ここでは、例としてトマト黄色葉カールウイルス(TYLCV)を用い、免疫蛍光法によるホワイトフライ中腸、一次唾液腺、および卵巣中のベゴモウイルスを局ース化するための詳細なプロトコルを記載する。この方法は、ウイルス被覆タンパク質、色素標識二次抗体、および共焦点顕微鏡に対する特異的抗体の使用に基づいている。このプロトコルは、ベゴモウイルスタンパク質とホワイトフライタンパク質の共局性化にも使用できます。さらに、定量PCR(qPCR)によるホワイトフライ中腸、一次唾液腺、ヘモリフ、卵巣におけるTYLCVの定量に関するプロトコルについて説明します。TYLCV用に特別に設計されたプライマーを使用して、定量のためのプロトコルは、ホワイトフライの異なる組織におけるTYLCVの量の比較を可能にする。記載されたプロトコルは、ホワイトフライおよびウイルス感染植物の体内におけるベゴモウイルスの定量化に有用である可能性がある。これらのプロトコルは、ホワイトフライ中のベゴモウイルスの循環経路を分析したり、ホワイトフライとベゴモウイルスの相互作用を研究する他の方法を補完するものとして使用することができる。
Introduction
過去数十年で、ベゴモウイルス(属ベゴモウイルス、ファミリージェミニビリダ)は、世界中の多くの野菜、繊維、および観賞用作物の生産に深刻な損害を与えました1.ベゴモウイルスは、35以上の不可解な種2、3を含む複雑な種である白飛ベミシアタバチ(ヘミプテラ:アレイロジダエ)によって永続的に伝えられる。ベゴモウイルスは、直接的または間接的に、フェクンディティ4、長寿4、および宿主の好み5、6などのホワイトフライの生理学および行動に影響を及ぼし得る。さらに、与えられたベゴモウイルス種/株の伝達効率は、同じ実験条件の下でも異なるホワイトフライの不可解種に対して異なり、7,8,9,10であり、ベゴモウイルスとホワイエとの間に複雑な相互作用があることを示す。ホワイトフライとベゴモウイルスの相互作用の根底にあるメカニズムをよりよく理解するためには、ホワイトフライ組織におけるウイルスの局在化および定量化が不可欠です。
トマト黄色葉カールウイルス(TYLCV)はイスラエルで最初に報告されたベゴモウイルスですが、今日では世界的にトマト生産に深刻な被害を引き起こします11,12.経済的に重要なため、最もよく研究されているベゴモウイルス13の1つです。他のモノアルタイ人ベゴモウイルスと同様に、TYLCVは、14の約2,800ヌクレオチドのゲノムサイズを有する一本鎖環状DNAウイルスである。まだ議論中ですが、いくつかの証拠行は、ホワイトフライ15、16、17でTYLCVの複製をサポートしています。また、TYLCV粒子とホワイトフライタンパク質との相互作用は6,18,19,20と報告されている。ウイルス感染の場合、シロナフライはウイルス感染植物に餌を与えてTYLCVを獲得し、ニビオンは食道に沿って食道に到達し、中腸壁を貫通してヘモリンフに到達し、次に一次唾液腺(PSG)に移動する。最後に、ビリオンは唾液管に沿って唾液を植物フロム21に沿って唾液で排出される。さらに、いくつかの研究は、TYLCVが雌の白いハエからその子孫22、23にトランスボリーで伝染することができることを示している。言い換えれば、生産的な伝染を達成するために、ウイルスはホワイトフライ内の細胞障壁を克服し、ある組織から別の組織に移動しなければならない。これらの障壁の交差中に、ホワイトフライとウイルスタンパク質の相互作用が起こりやすく、おそらくウイルスが伝染する効率を決定する。
免疫蛍光はタンパク質分布解析に一般的に使用される手法です。抗体の抗原への結合の特異性は、免疫蛍光の基礎を形成する。TYLCVの経済的意義のために、TYLCVコートタンパク質に対するモノクローナル抗体が開発されており、ウイルス24を局所化する非常に敏感な方法を提供している。定量 PCR (qPCR) は、核酸の感度と特異的な定量を可能にします。この技術は、加水分解プローブ(例えば、TaqMan)または蛍光色素(例えば、SYBR Green)検出の使用に最も頻繁に基づく。加水分解プローブベースのqPCRでは、特定のプローブが必要となり、その結果、コストが増加します。蛍光色素ベースのqPCRは、標識アンプリコン特異的ハイブリダイゼーションプローブが25を必要としないため、より簡単でコスト効率が高い。これまでに、いくつかの研究では、複雑なベゴモウイルスとホワイトフライの相互作用を調査するために、他の方法と共に免疫蛍光およびqPCRを使用してきました。例えば、Pan et al. ホワイトフライ組織におけるウイルスのqPCRおよび免疫蛍光分析を行い、シロナリ種のアジアII1と中東アジアマイナー1(MEAM1)の間でタバコ巻き毛シュートウイルス(TbCSV)を送信する能力の違いは、ウイルスがアジアII1の中腸壁を効率的に横断できることによるものであることがわかった。同様に、地中海(MED)ホワイエはTYLCVを容易に伝播できるが、トマト黄色葉カール中国ウイルス(TYLCCNV)を伝播することができない。選択的伝達は、PSGにおけるウイルスの免疫蛍光検出を用いて調査されたが、これはTYLCCNVがMEDホワイトホエ26のPSGを容易に横断しないことを示した。ホワイトフライ中腸におけるTYLCV CPとオートファジーマーカータンパク質ATG8-IIの免疫蛍光共局在化は、オートファジーがホワイトフライ27におけるTYLCVの感染を抑える上で重要な役割を果たしていることを示している。
ここで、TYLCVを例に用いて、免疫蛍光技術によるホワイトフライ中腸、PSG、卵巣におけるベゴモウイルスの局在化に関するプロトコルを説明する。この技術は、一次抗体および色素標識二次抗体による解剖、固定、およびインキュベーションを含む。ホワイトフライ組織中のウイルスタンパク質の位置を示す蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡下で検出できます。さらに重要なことに、このプロトコルは、ベゴモウイルスおよびホワイトフライタンパク質を共局化するために使用することができる。さらに、ホワイトフライ中腸、PSG、ヘモリオン、卵巣におけるSYBRグリーンベースのqPCRを用いたTYLCVの定量のプロトコルについて説明し、異なるホワイトフライ組織サンプル中のウイルス量を比較するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、免疫蛍光およびqPCRによるホワイトフライベクターの組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のためのプロトコルについて説明する。解剖は、ホワイトフライ組織におけるウイルスを局所化し、定量化するための最初のステップを表す。ホワイトフライの体は長さが約1mmで、組織が非常に小さく、解剖することが困難であることを意味します。その上、組織間には強いつ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国家主要研究開発プログラム(助成金番号:2017YFD0200600)、中国農業研究システム(助成金番号:CARS-23-D07)とビル&メリンダ・ゲイツ財団(投資ID OPP1149777)の目印基金によって支援されました。).TYLCV CP抗体を提供してくれたジャンシャン・ウー教授に感謝します。
Materials
| 4% Paraformaldehyde | MultiSciences | F0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Abcam | ab104139 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MultiSciences | A3828 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-RAD | 185-5201 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Dylight 549-goat anti-mouse | Earthox | E032310-02 | Secondary antibody |
| Monoclonal antibody (MAb 1C4) | Primary antibody | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548119-0500 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| TB green premix Ex Taq (Tli RNase H Plus) | TaKaRa | RR820A | qPCR master mix |
| Thermocycler | Thermofisher | A41182 | |
| Tissuelyzer | Shaghai jingxin | Tissuelyser-48 | |
| Triton-X-100 | BBI life sciences | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | BBI life sciences | 9005-64-5 |
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