染色质免疫沉淀与下一代测序(ChIP-seq)相结合,是一种用于建立转录因子与其控制的基因组序列之间的相互作用的方法。该协议概述了使用细菌生物膜执行ChIP-seq的技术,以沙门氏菌肠杆菌菌膜为例。
染色质免疫沉淀,然后是测序(ChIP-seq)是一种可用于发现转录因子、组蛋白修饰和其他DNA相关蛋白质的调控靶点的技术。ChIP-seq 数据还可用于查找不同环境条件或细胞类型中转录因子的差分结合。最初,ChIP是通过微阵列(ChIP芯片)的杂交执行;然而,通过技术进步、减少测序的财务障碍和大量高质量的数据输出,ChIP-seq 已成为首选方法。本协议描述了用细菌生物膜(持续和慢性感染的主要来源)进行ChIP-seq的技术。ChIP-seq对沙门氏菌进行血清素型血球生物膜和浮游细胞,以主生物膜调节器CsgD为目标,以确定两种细胞类型的差分结合。在这里,我们演示了要收获的适当数量的生物膜,归一化为平面控制样品,对交叉链接器访问进行均质化生物膜,并执行常规 ChIP-seq 步骤以获得高质量的测序结果。
细菌生物膜,嵌入自产基质的细胞结构聚合体,对干燥、抗生素和宿主免疫反应具有抗药性1。因此,它们会导致持续和慢性感染,并由于其生存和传播的解决方案给研究人员带来独特的挑战。沙门氏菌肠血清素型图(S.Typhimurium) 已发现,它建立了对干燥和抗生素具有抗药性的生物膜聚集体,以及当暴露于环境压力(28°C,限制营养)2 时在纯培养中表达毒性因子的浮游细胞。这两种细胞类型产生是由于主生物膜调节器CsgD3的双稳态表达。我们假设这可能是沙门氏菌的押注对冲策略,其中浮游细胞参与短期传播,生物膜细胞能够长期在环境中存在,直到有机会感染新的宿主出现2,4。控制csg操作器表达式的许多监管元素都很好地描述了5。然而,除了adrA和csg operon6之外,很少知道CsgD的监管目标。识别 CsgD 监管网络将有助于我们更好地了解沙门氏菌的生命周期以及生物膜在传播中的作用。
染色质免疫沉淀后,高通量测序(ChIP-seq)是一种强大的体内技术,用于全基因组识别蛋白质-DNA相互作用,并提供涉及转录因子、组蛋白修饰或核小体7的调控过程信息。较新的研究已经使用这种技术来评估生长条件和细胞类型8之间的差别蛋白结合。在染色质免疫沉淀(ChIP)中,通过抗体选择靶蛋白,与相互作用的蛋白质的DNA片段得到丰富。细胞被收获,DNA结合蛋白通过甲醛交叉链接处理与体内的DNA交叉链接。细胞被裂解,释放细胞内容物,染色质被切成大约200-600 bp片段7。与靶蛋白结合的DNA片段使用抗体进行免疫沉淀,通过去交联分离分离,然后进行蛋白质消化9。这些DNA片段代表蛋白质结合位点,通过杂交与微阵列(ChIP芯片)或深度测序和映射到基因组序列10,11进行匹配。虽然ChIP芯片实验产生足够的监管数据,但由于使用昂贵的探头,以及杂交和阵列偏置12,它们是有限的。与ChIP芯片7相比,ChIP-seq具有更大的动态范围,具有更高的核苷酸分辨率和覆盖范围,提高了信噪比,工件更少。
ChIP 已用于分析沙门氏菌血清素 Typhimurium13,14,仲裁感应阿芙A调节在维布里奥藻基利物15, RpoS 调节在埃舍ichi 大肠杆菌16,毒性调节器EspR法规在分枝杆菌结核病17,潜在的二聚氰酸酯环酶通过AmrZ法规在伪单子aeruginosa18,以及VraSR金黄色葡萄球菌19号。细菌ChIP-seq实验,已经描述开始生长细胞在液体介质和收获在单细胞的形式。然而,对生物膜和相应的基因调控的分析代表了一组新的挑战,以产生成功的ChIP-seq协议。在此协议中,ChIP-seq 用于查找 CsgD、 S 的差别监管目标。在生物膜和浮游细胞类型中,Typhimurium 主生物膜调节器。该协议描述了用于确定ChIP-seq适当数量的生物膜、从烧瓶培养中收获生物膜、使生物膜和单细胞控制样品标准化、生物膜均质化和完全免疫沉淀的技术。这将有助于研究细菌生物膜中的调节目标,并可适用于许多物种。
该协议概述了一种使用肠菌种血清素和纯培养体中的浮游细胞执行ChIP-seq的技术,以查找主生物膜调节器CsgD的调控目标。我们预计差异结合信息是由于两种细胞类型中CsgD的双稳定性,生物膜聚合水平高,浮游细胞2、3低水平。然而,这种技术也可以应用于其他细菌转录因子、细胞类型或生长条件。特别是,该技术可应用于其他细菌生物膜,使用实验确定的CFU每单位重量生物膜细胞的转化因子。
ChIP-seq 可通过测序放大技术误差;然而,在关键步骤的确认可以防止这27。原抗体特异性对于在免疫沉淀7期间仅选择靶转录因子及其控制的DNA非常重要。在这个实验中,csgD被融合到基因3’端的质粒编码3xFLAG标记中,对应于CsgD2的C端。不含csgD的p3xFLAG质粒被用作”对照“(S.Typhimurium 14028 [csgD ] p3xFLAG)。ENCODE指南建议用原抗体对感兴趣的蛋白质进行免疫博物,以及ChIP菌株和缺失菌株的解毒物21。必须确保在复制中的生长条件一致,以减少转录因子结合和下游测序结果的可变性。如果谨慎确保接种大小和接种前生长条件一致,烧瓶培养的生物膜生长是一致的4。确认所有生物膜在均质化后均质分离非常重要,以确保试剂,特别是甲醛交叉链接剂平等进入所有细胞。
一些修改可能使研究人员将该协议用于其他DNA结合蛋白、细胞类型、菌株、生长条件或实验室设备。如果它用于生物膜形成物种以外的S.地膜,菌落形成单位每单位重量的生物膜的转换系数需要通过收获不同量的生物膜,使生物膜彻底均匀化,并进行连续稀释和板计数来形成标准曲线,在较低的生物膜重量2下可能不准确。声波能量转移和细胞类型电阻可能不同;因此,建议采用声波测定法,以找出能产生下游库制备和测序11所需的片段大小范围的声波爆发数。微球核酸分片是声波的替代方法,可产生高分辨率的占用场所;然而,这种方法可能会引入碎片偏置7,28。DNA 大小范围可能会根据下游库制备试剂盒和测序平台而改变。其他均质化方法可用于代替混合器磨机。例如,玻璃组织均质器可以替代,但它可能会气溶胶或不完全分解生物膜。在控制方面,免疫前沉淀DNA可以在测序后处理和分析中规范化。具有物种匹配正常抗体血清的模拟IP控制也可以用作控制13。
在考虑 ChIP-seq 实验时,研究人员必须考虑这种方法的局限性。可能需要进行重大修改,以适应其他生物膜类型。例如,在PBS中立即重新悬浮生物膜的沙门氏菌会导致生物膜聚集体可测量的损失。针对细菌转录因子的调节目标的免疫沉淀可能导致非常少量的DNA,这是后期纯化和检测的挑战。在库检测9期间,剪切和下游操作过程中可以引入偏置。此外,此方法不会显示体内表达水平,以响应转录因子结合。缺乏生物信息学经验的研究人员可能会受到分析管道的挑战。此方法可能耗时和昂贵;然而,测序的成本往往低于微阵列,而且随着技术改进的不断进行,成本正在逐渐下降。
文献中很少有方法描述ChIP与细菌,大多数细菌实验开始与一个简单的生长条件13,14,15,17,18。与使用生物膜聚合体制备 ChIP 样品相比,使用单细胞制备 ChIP 样品制备非常简单,且挑战更少。至于ChIP-seq,以前研究顺子调节电路的方法,包括通过指数扩能(SELEX)、电泳移动移位测定(EMSA)、ChIP芯片、启动子删除和报告器分析系统进化配体的方法,已由ChIP-seq29补充或取代。由于技术的进步和测序的可用性,ChIP-seq 正在取代 ChIP 芯片。深度测序为研究人员提供了海量的数据,能够识别具有较低结合亲和力和更高的碱基对分辨率的位点,其起始材料比ChIP芯片11、30更少。从具有高质量参考基因组的生物体中分析ChIP数据通常快速而具体。此外,ChIP-seq 是一种彻底的方法,用于发现在 silico 预测结合位点中,这些位点可能并非在所有细胞类型、生长阶段或环境条件31中都占有。
将来,该协议可用于促进对细菌发病机制,特别是生物膜形成生物的了解。广泛采用这种技术和提供新的数据集可以导致数据集成,以确定蛋白质组,共同本地化,以控制细胞过程的生物膜形成微生物32。此外,ChIP-seq和RNA-seq数据可以集成,以建立监管系统模型33。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了自然科学和工程研究理事会(NSERC)(#2017-05737)和通过Jarislowsky生物技术主席的资助。通过萨斯喀彻温大学传染病、食品安全和公共政策综合培训方案(ITraP),议员获得NSERC-CREATE奖学金的支持。
作者要感谢丹妮·戴尔的拍摄和编辑。
Agarose powder | FroggaBio | A87-500G | |
Balance (Explorer pro) | Ohaus | EP214 | |
Benchtop Centrifuge (8510R) | Eppendorf | 022627023 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2939BA | |
BR dsDNA kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | COEDTAF-RO ROCHE | |
Conical tube 15 mL | FroggaBio | TB15-500 | |
Conical tube 50 mL | FroggaBio | TB50-500 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | |
Disposable Cuvette, 1.5 mL | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) | Bio-Rad | 1658000 | |
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) | Thermo Scientific | 728211 | |
Fluorometer (Qubit 3.0) | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water | Biotium | 41003 | |
High Sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
Incubator (shaking) | VWR | 1570-ZZMFG | |
Incubator (Water bath shaking) | New Brunswick | G76D | |
LB media | VWR | 90000-808 | |
Magnetic stand (DynaMag) | Fisher Scientific | 12321D | |
Microcentrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5415R | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Mixer mill | Retsch | MM400 | |
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size | Thermo Scientific | 73520-980 | |
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7370S | |
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads | Machery-Nagel | 744970.5 | |
Normal mouse serum | AbCam | ab188776 | |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette controller | FroggaBio | MP001 | |
Proteinase K | ThermoFisher Scientific | AM2542 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody | Sigma-Aldrich | F7425 | |
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Rotating wheel | Crystal Technologies & Industries | TR 01A | |
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) | Eppendorf | 22363344 | |
Serological pipette 25 mL | FroggaBio | 94024 | |
Spectrophotometer | Montreal Biotech Inc. | Libra S22 | |
Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | 630-0418 | |
Tryptone media | VWR | 90000-286 | |
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) | Sonics & Materials, Inc. | VC300 | |
Vacuum equipment (Vacufuge plus) | Eppendorf | 022820001 | |
Water bath 1 (Lab-line aquabath) | Thermo Scientific | 18000-1 | |
Water bath 2 (Precision) | Thermo Scientific | 51221044 |