एक संयोजन एकल डोमेन एंटीबॉडी लाइब्रेरी के स्टेपवाइज फाग चयन द्वारा अत्यधिक विशिष्ट रासायनिक प्रेरित प्रोटीन डामरीकरण सिस्टम बनाना
Summary
किसी भी छोटे अणु लिगामेंट के लिए वांछित आत्मीयता और विशिष्टता के साथ रासायनिक रूप से प्रेरित प्रोटीन डामरीकरण प्रणाली बनाने में कई जैविक संवेदन और एक्टयूशन अनुप्रयोग होंगे। यहां, हम एक phage प्रदर्शित संयोजन एकल डोमेन एंटीबॉडी पुस्तकालय के स्टेपवाइज चयन के माध्यम से रासायनिक प्रेरित डामरीकरण प्रणालियों के डी नोवो इंजीनियरिंग के लिए एक कुशल, सामान्यीकरण विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
प्रोटीन डामरीकरण की घटनाएं जो केवल एक छोटे-अणु लिगामेंट की उपस्थिति में होती हैं और जैविक रास्तों के विच्छेदन और हेरफेर के लिए छोटे अणु बायोसेंसर के विकास को सक्षम करती हैं। वर्तमान में, केवल रासायनिक रूप से प्रेरित डामरीकरण (सीआईडी) प्रणालियों की एक सीमित संख्या मौजूद है और विशिष्ट छोटे अणु ligands के लिए वांछित संवेदनशीलता और चयनात्मकता के साथ नए लोगों को इंजीनियरिंग प्रोटीन इंजीनियरिंग के क्षेत्र में एक चुनौती बनी हुई है । हम यहां एक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि, कॉमबिनेटोरियल बिनडेर्स-ई एनएबीड एससीआईडी (एनकोन्स-सीआईडी) के चुनाव का वर्णन करते हैं, सीआईडी सिस्टम की डी नोवो इंजीनियरिंग के लिए जो बड़ी विविधता के लिए लागू होती है। यह विधि 1 प्राप्त करने के लिए एक phage-प्रदर्शित संयोजन naकोई पुस्तकालय के दो चरण चयन का उपयोग करता है) “एंकर बाइंडर्स” जो पहले ब्याज के लिगामेंट से बांधते हैं और फिर 2) “डिमराइजेशन बाइंडर्स” जो केवल एंकर बाइंडर-लिगामेंट कॉम्प्लेक्स से बांधते हैं। एंकर बाइंडर्स का चयन करने के लिए, 109 से अधिक पूरकता-निर्धारक क्षेत्र (सीडीआर) की एक संयोजन पुस्तकालय – यादृच्छिक नैनोबॉडी को बायोटिनेटेड लिगांड के साथ जांच की जाती है और हिट को बायो-लेयर इंटरफेरोमेट्री (BLI) द्वारा अलेबल लिगलैंड के साथ मान्य किया जाता है। डिमराइजेशन बाइंडर्स प्राप्त करने के लिए, नकोई लाइब्रेरी सकारात्मक स्क्रीनिंग के लिए लक्ष्य और नकारात्मक स्क्रीनिंग के लिए अनबाउंड एंकर बाइंडर्स के रूप में लंगर बांधने वाले लिगामेंट कॉम्प्लेक्स के साथ जांच की जाती है । जोड़ती-सीआईडी मोटे तौर पर अन्य इम्यूनोग्लोबुलिन, गैर इम्यूनोग्लोबुलिन, या गणना रूप से डिजाइन किए गए मचानों के साथ सीआईडी बांधने वालों का चयन करने के लिए लागू होता है ताकि इन विट्रो के लिए बायोसेंसर बनाया जा सके और दवाओं, मेटाबोलाइट्स, सिग्नलिंग अणुओं आदि का विवो डिटेक्शन बनाया जा सके।
Introduction
सीआईडी सिस्टम, जिसमें दो प्रोटीन केवल एक छोटे-अणु लिगांड(चित्रा 1)की उपस्थिति में डिमेराइज़ करते हैं, मेटाबोलिक, सिग्नलिंग और अन्य जैविक रास्तों को विच्छेदन और हेरफेर करने के लिए बहुमुखी उपकरण प्रदान करतेहैं। उन्होंने दत्तक टी सेल थेरेपी की सुरक्षा और प्रभावकारिता में सुधार के लिए जैविक एक्क्यूशन में क्षमता का प्रदर्शन किया है, जैसे ड्रग-नियंत्रित टी सेल एक्टिवेशन2 और एपोप्टोसिस3,4। इसके अतिरिक्त, वे वीवो में या छोटे अणु लक्ष्यों का इन विट्रो पता लगाने के लिए एक नई पद्धति प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, सीआईडी प्रोटीन आनुवंशिक रूप से फ्लोरेसेंस रिपोर्टर सिस्टम (जैसे, फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET)5 और परिपत्र रूप से छिद्रित फ्लोरोसेंट प्रोटीन)6 वीवो माप में वास्तविक समय के लिए, या सैंडविच एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) के लिए आत्मीयता अभिकर्मकों के रूप में काम कर सकते हैं।
उनके व्यापक अनुप्रयोगों के बावजूद, नए सीआईडी सिस्टम बनाने कि एक दिया छोटे अणु ligand द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है बड़ी चुनौतियों का सामना करना पड़ता है । पशु प्रतिरक्षण7,इन विट्रो चयन8,9,और कम्प्यूटेशनल प्रोटीन डिजाइन10 सहित स्थापित प्रोटीन बाइंडर इंजीनियरिंग विधियां लिगामेंट बाध्यकारी प्रोटीन उत्पन्न कर सकती हैं जो बाइनरी प्रोटीन-लिगामेंट इंटरैक्शन के माध्यम से कार्य करती हैं। हालांकि, इन तरीकों से लिगामेंट प्रेरित टर्नरी सीआईडी कॉम्प्लेक्स बनाने में दिक्कतें होती हैं। कुछ विधियां रासायनिक रूप से दो लिगांडों को जोड़कर सीआईडी बनाती हैं जो स्वतंत्र रूप से समान या विभिन्न प्रोटीन11,12,13,14,15,16 से बांधते हैं या पहले से मौजूद छोटे अणु-प्रोटीनपरिसरों17,18को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी जैसे बाइंडर प्रोटीन का चयन करने पर भरोसा करते हैं, और इस प्रकार लिगांड का सीमित विकल्प है।
हमने हाल ही में सीआईडीसिस्टम्स 19के डी नोवो इंजीनियरिंग के लिए सीआईडी (एनकोन्स-सीआईडी) विधि के एक कॉमबिनेटोरियल बिनडेर्स-ई नाब्ड एसइलेक्शन विकसित किए हैं । यह विधि लिगांड-प्रेरित डामरीकरण (उदाहरण के लिए, एंकर-डिमराइजेशन बाइंडर विच्छेदन स्थिर, केडी (लिगांड के बिना)/केडी (लिगांड के साथ) और 1,000) की उच्च विशिष्टता प्राप्त कर सकती है। डिमराइजेशन विशिष्टता लचीला बाध्यकारी साइटों के साथ एंकर बांधने का उपयोग करके हासिल की जाती है जो लिगाण्ड बाइंडिंग पर संरचनापरिवर्तन शुरू कर सकती है, केवल लिगांड-बाउंड एंकर बाइंडर्स को पहचानने के लिए एक आधार प्रदान करती है। हमने कैनाबिडिओल (सीबीडी) -नैनोबॉडी के प्रेरित हेटेरोडिमर, कैमलिड से 12-15 केडीए कार्यात्मक एंटीबॉडी टुकड़ा बनाकर एक सबूत-सिद्धांत का प्रदर्शन किया जिसमें एक सार्वभौमिक पाड़ और तीन लचीला सीडीआर लूप(चित्रा 2)20शामिल हैं, जो छोटे अणु एपिटोप21, 22के लिए अनुकूलनीय आकार के साथ एक बाध्यकारी जेब बना सकते हैं। विशेष रूप से, एक संयोजन प्रोटीन पुस्तकालय का इन विट्रो चयन सीआईडी इंजीनियरिंग के लिए लागत प्रभावी और सामान्यहोना चाहिए क्योंकि एक ही उच्च गुणवत्ता वाली लाइब्रेरी को विभिन्न लिगांड पर लागू किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल और वीडियो में, हम दो कदम में विट्रो चयन और एंकर के सत्यापन का वर्णन करने पर ध्यान केंद्रित(चित्रा 3ए)और डिमराइजेशन बाइंडर्स(चित्रा 3बी)एक लक्ष्य के रूप में सीबीडीका उपयोग कर अधिक विविधता के साथ संयोजन naकोई पुस्तकालय स्क्रीनिंग द्वारा, लेकिन प्रोटोकॉल अंय प्रोटीन पुस्तकालयों या छोटे अणु लक्ष्यों पर लागू होना चाहिए । सीआईडी बांधने वालों की स्क्रीनिंग में आमतौर पर 6-10 सप्ताह(चित्रा 4)लगते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बायोपैनिंग के विभिन्न दौरों के लिए इनपुट फाज पुस्तकालयों की सही सांद्रता का चयन करना महत्वपूर्ण है। हम आम तौर पर एक विविधता और gt;109के साथ ~ 1012-1013 phage कणों के एक इनपुट पुस्तकालय से शुरू किया, प्रत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को वाशिंगटन नवाचार पुरस्कार विश्वविद्यालय (एलजी को) द्वारा समर्थित किया गया था, जो अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (1R35GM128918 से L.G.) से अनुदान, और वाशिंगटन विश्वविद्यालय (एलजी के लिए) का एक स्टार्टअप फंड है । एचजे को वाशिंगटन रिसर्च फाउंडेशन की स्नातक फैलोशिप का समर्थन मिला । केडब्ल्यू को यूनिवर्सिटी ऑफ वाशिंगटन इंस्टीट्यूट फॉर प्रोटीन डिजाइन से स्नातक फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
References
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