Summary

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Published: January 14, 2020
doi:

Summary

יצירת מערכות דימרזציה בתחום החלבונים עם הזיקה הרצויה וספציפיות לכל מולקולה קטנה שניתנה לפני הרבה מולקולות ובקשות חישה והגשמה. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה, הניתן להכליל עבור דה נובו הנדסה של מערכות דימריזציה הנגרמת כימית דרך הבחירה החורגת של קומבינטורית הציג phage בספרייה נוגדן יחיד בתחום.

Abstract

אירועים מדימריזציה של חלבונים המתרחשים רק בנוכחות של מולקולה קטנה ומאפשרים פיתוח של מולקולה קטנה ביולוגית לניתוח ומניפולציה של מסלולים ביולוגיים. כיום, רק מספר מוגבל של מערכות dimerization בהשפעת כימית (CID) קיימים והנדסה חדשים עם רגישות הרצויה וסלקטיביות עבור ליגניות מולקולות קטנות מסוימות נשאר אתגר בתחום הנדסת חלבונים. אנו מתארים את השיטה הקרנת תפוקה גבוהה, comביננדרס בן ders-e nabled הבחירות שלסיד (משלב סיד), עבור דה נובו הנדסה של סיד מערכות החלים על מגוון רחב של ליגנדס. שיטה זו משתמשת בבחירה בשני השלבים של הספרייה phage מוצג קומבינטורית ננוגוף כדי לקבל 1) “עוגן אוגדן” כי לאגד הראשון כדי להשיג ולאחר מכן 2) “dimerization קלסרים” כי רק לאגד עוגן מאגד-ליגנד מכלולי. כדי לבחור בקלסרים עוגן, ספריית קומבינטורית של מעל 109 האזור משלימה לקביעת (cdr)-ננוגופים אקראיים מוקרן עם ligtinylated וכניסות מאומתים עם ליגנד על ידי ביולוגי אינטרפרומטריה (בלי). כדי להשיג בקלסרים dimerization הספרייה הננו מוקרן עם העוגן קלסר-ligand מכלולי כמטרות עבור הקרנה חיובית ואוגדן עוגן מאוגד עבור הקרנה שלילית. משלבת-CID ישימה באופן כללי כדי לבחור בקלסרים CID עם חיסוני אחרים, non-חיסוני, או בחינה חישובית עוצב מתוכננת הפיגומים כדי ליצור ביוחיישנים עבור מבחנה ב-vivo זיהוי של תרופות, מטבוליטים, מולקולות איתות, וכו ‘.

Introduction

CID מערכות, שבו שני חלבונים dimerize רק בנוכחות של מולקולה קטנה (איור 1), מציעים כלים רב-תכליתי לניתוח ותפעול מטבולית, איתות, ומסלולים ביולוגיים אחרים1. הם הפגינו את הפוטנציאל בהפעלה ביולוגית, כגון הפעלה מבוקרת סמים T2 ו אפופטוזיס3,4, לשיפור הבטיחות והיעילות של טיפול תא T המאמצת. בנוסף, הם מספקים מתודולוגיה חדשה בvivo או בזיהוי מתורבת של מטרות מולקולות קטנות. לדוגמה, חלבונים CID יכול להיות התמזגו גנטית עם מערכות העיתונאי הניאון (g., העברת אנרגיה בתהודה של אור השמש (למשל)5 ו מעגליות חלבונים פלורסנט מושתק)6 עבור בזמן אמת במדידות vivo, או לשמש ריאגנטים אהדה עבור כריך האנזים מקושר חיסוני כפוף (אליסה)-כמו assays.

למרות היישומים הרחבים שלהם, יצירת מערכות CID חדשות שיכולות להיות נשלטות על-ידי מולקולה קטנה ובעלת אתגרים מרכזיים. הוקמה שיטות הנדסה חלבון קלסר כולל חיסון בעלי חיים7, בחירה מחוץ גופית8,9, ועיצוב חלבון חישובית10 יכול ליצור ליגנד מחייב חלבונים הפועלים באמצעות חלבון בינארי-ליגנד אינטראקציות. עם זאת, שיטות אלה יש קשיים ביצירת מתחם CID ליגארי המושרה. כמה שיטות ליצור סיד על ידי קישור כימי שני ליגניות כי באופן עצמאי לאגד את אותם חלבונים או שונים11,12,13,14,15,16 או להסתמך על בחירת חלבונים קלסר כגון נוגדנים ליעד מולקולה קטנה מולקולת חלבון מתחמים17,18, ולכן יש מבחר מוגבל של ליגנדס.

פיתחנו לאחרונה מקוםהבחירה של החבר ‘ הe NABLEDהבחירות של סיד (משלבת סיד) שיטה עבור דה נובו הנדסה של סיד מערכות19. שיטה זו יכולה להשיג את היחודיות הגבוהה של דימרזציה (לדוגמה, קבוע עוגן-דימרזציה, kd (ללא Ligand)/kd (עם ligand) > 1,000). ספציפיות הדימרזציה מושגת באמצעות קלסרים עוגן עם אתרי קשירה גמישים שיכולים להציג שינויים מתרניים עם ליגנד מחייב, מתן בסיס לבחירה של קלסרים סלקטיבי מבחינה מבצעית רק לזהות ליגור העוגן אוגדן. הדגמנו הוכחה של עקרון על ידי יצירת קנאידיל (CBD) המושרה הטרודימרס של nanobodies, 12 – 15 מקטע נוגדן מסוג kda מתוך גמליים הכוללת פיגום אוניברסלי ושלושה cdr לולאות גמיש (איור 2)20, אשר יכול ליצור כיס מחייב עם הגדלים של מולקולהקטנה מולקולות21. בעיקר, הבחירה מחוץ גופית של ספריית החלבון קומבינטורית צריך להיות חסכוני וכללי עבור הנדסת CID, כי הספרייה באיכות גבוהה ניתן להחיל על ליגניות שונות.

בפרוטוקול זה וידאו, אנו מתמקדים בתיאור שני שלבים בחירת מבחנה ואימות של עוגן (איור 3A) ו dimerization קלסרים (איור 3ב) על ידי הקרנת ספריית קומבינטורית nanobody עם גיוון גבוה יותר 109 באמצעות CBD כיעד, אבל הפרוטוקול צריך להיות ישים לספריות חלבון אחרות או מולקולות קטנות מטרות. ההקרנה של בקלסרים CID לוקח בדרך כלל 6 – 10 שבועות (איור 4).

Protocol

1. בניית ספרייה השתמש קומבינטורית סינתטי מתחם יחיד בספריית הנוגדן עם מגוון של ~ 1.23 – 7.14 x 109, כפי שתוארה בעבר19. בעוד שפרוטוקול זה אינו כולל בניית ספריות, ניתן להחילו על ספריות אוגדן אחרות הקומבינטורית. 2. ביוטילציה של ליג, מטרה או ליגטין Biotinylate א?…

Representative Results

אנו מתארים את שני השלבים בבחירת מבחנה ואימות של העוגן ו dimerization קלסרים על ידי הקרנת הספרייה קומבינטורית ננוbody עם גיוון גבוה יותר 109 באמצעות CBD כיעד. הערכת העשרת ביואננינג במהלך הסיבובים הרצופים של בחירת העוגן והדימרזציה, חשובה ביותר. תוצאות העשרה טיפוסיות לאחר 4 – 6 סיבובים של בחירה כפ…

Discussion

חשוב לבחור את הריכוזים הנכונים של ספריות phage קלט עבור סיבובים שונים של ביואננינג. אנחנו בדרך כלל התחלנו מספריית הקלט של ~ 1012– 1013 phage חלקיקים עם גיוון > 109, המאפשר ~ 100-1000 עותקים של כל שיבוט phage להיות מוצג בתוך שיטת המשיכה למטה. אם הריכוז phage בתוך הסדר מחייב הוא גבוה מדי או נמוך, ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי פרס החדשנות אוניברסיטת וושינגטון (כדי L.G.), מענק של U.S. המכונים הלאומיים לבריאות (1R35GM128918 כדי L.G.), ו קרן אתחול של אוניברסיטת וושינגטון (כדי L.G.). H.J. היתה נתמכת על ידי מלגת קרן וושינגטון למחקר. K.W. נתמכת על ידי מלגת לתואר ראשון מהמכון לעיצוב חלבונים באוניברסיטת וושינגטון.

Materials

1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

References

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. . The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

View Video