Opprette kjemisk indusert protein dimerization systemer med ønsket affinitet og spesifisitet for et gitt lite molekyl ligand ville ha mange biologiske sensing og aktivering applikasjoner. Her beskriver vi en effektiv, generaliserings metode for de Novo engineering kjemisk indusert dimerization systemer via trinnvis utvalg av en phage Kombinatorisk ett domene antistoff bibliotek.
Protein dimerization hendelser som forekommer bare i nærvær av et lite molekyl ligand muliggjøre utvikling av små molekyl biosensors for disseksjon og manipulering av biologiske veier. Foreløpig bare et begrenset antall kjemisk indusert dimerization (CID) systemer eksisterer og engineering nye med ønsket følsomhet og selektivitet for bestemte små-molekylet ligander fortsatt en utfordring innen protein engineering. Vi her beskriver en høy gjennomstrømming screening metode, combinatorial binders-eYLL svalg av Cid (kombinerer-CID), for de Novo engineering av Cid-systemer som gjelder for et stort utvalg av ligander. Denne metoden bruker to-trinns valg av et phage-viste Kombinatorisk nanobody bibliotek for å få 1) “anker bindemidler” som først binder til en ligand av interesse og deretter 2) “dimerization bindemidler” som bare binder til anker bindemiddel-ligand komplekser. For å velge anker bindemidler er et Kombinatorisk bibliotek med over 109 komplementaritet-fastsettelse (CDR)-randomisert nanobodies vist med en biotinylated ligand og treff valideres med umerkede ligand av bio-Layer LABORATORIEFASILITETER (bli). For å få dimerization bindemidler, nanobody biblioteket er vist med anker bindemiddel-ligand komplekser som mål for positiv screening og de ubundne anker bindemidler for negativ screening. KOMBINERER-CID er grovt aktuelt å velge CID-bindemidler med andre immunglobulin, ikke-immunglobulin eller beregningsmessig utformet stillaser for å skape biosensors for in vitro-og in vivo-deteksjon av legemidler, metabolitter, signalmolekyler osv.
CID-systemer, der to proteiner dimerize bare i nærvær av et lite molekyl ligand (figur 1), tilbyr allsidige verktøy for dissekere og manipulere metabolske, signalering, og andre biologiske trasé1. De har vist potensialet i biologisk aktivering, som for eksempel stoff-kontrollerte T celle aktivering2 og apoptose,for å forbedre sikkerheten og effekten avadoptiv-tcelle terapi. I tillegg gir de en ny metodikk for in vivo eller in vitro deteksjon av små molekyl mål. For eksempel kan CID proteiner være genetisk smeltet sammen med fluorescens reporter systemer (f. eks, fluorescens resonans energi overføring (bånd)5 og sirkulært permuted fluorescerende proteiner)6 for sanntids in vivo målinger, eller tjene som affinitet reagenser for sandwich enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (Elisa)-lignende analyser.
Til tross for deres brede bruksområder, har det å skape nye CID-systemer som kan styres av et gitt lite molekyl ligand store utfordringer. Etablert protein binder engineering metoder inkludert dyr immunisering7, in vitro utvalg8,9, og beregningsorientert protein design10 kan generere ligand bindende proteiner som fungerer via binære protein-ligand interaksjoner. Disse metodene har imidlertid vanskeligheter med å skape et ligand-indusert trefoldig CID-kompleks. Noen metoder skaper Cid av kjemisk linking av to ligander som uavhengig binder til samme eller forskjellige proteiner11,12,13,14,15,16 eller stole på å velge bindemiddel proteiner som antistoffer rettet mot eksisterende små molekyl-protein komplekser17,18, og dermed har et begrenset utvalg av ligander.
Vi har nylig utviklet en combinatorial binders-eYLL svalg av Cid (kombinerer-CID) metode for de Novo engineering av Cid systemer19. Denne metoden kan få den høye spesifisitet av ligand-indusert dimerization (f. eks en anker-dimerization bindemiddel dissosiasjon konstant, Kd (uten ligand)/Kd (med ligand) > 1 000). Den dimerization spesifisitet oppnås ved hjelp av anker bindemidler med fleksible bindende nettsteder som kan innføre conformational endringer ved ligand binding, noe som gir grunnlag for valg av conformationally selektive bindemidler bare erkjenner ligand-bundet anker bindemidler. Vi demonstrerte et proof-of-prinsipp ved å skape cannabidiol (CBD)-indusert heterodimerer av nanobodies, en 12-15 KDA funksjonelt antistoff fragment fra Kamelid bestående av et universelt stillas og tre fleksible CDR løkker (figur 2)20, som kan danne en bindende lomme med tilpasningsdyktige størrelser for små-molekyl epitopes21,22. Spesielt, in vitro utvalg av et Kombinatorisk protein bibliotek bør være kostnadseffektiv og generaliserings for CID engineering fordi det samme høykvalitets biblioteket kan brukes på ulike ligander.
I denne protokollen og video, fokuserer vi på å beskrive de to-trinns in vitro utvalg og validering av anker (Figur 3A) og Dimerization bindemidler (Figur 3B) ved screening Kombinatorisk nanobody biblioteket med et mangfold høyere enn 109 bruker CBD som et mål, men protokollen bør være gjeldende for andre protein biblioteker eller små-molekylet mål. Screening av CID bindemidler tar vanligvis 6 – 10 uker (Figur 4).
Det er viktig å velge riktig konsentrasjoner av input phage biblioteker for ulike runder av biopanning. Vi vanligvis startet fra en input bibliotek av ~ 1012-1013 phage partikler med et mangfold > 109, slik at ~ 100-1000 eksemplarer av hver phage klone skal presenteres i pull-Down analysen. Hvis phage konsentrasjon i en bindende analysen er for høy eller lav, vil sannsynligheten for uspesifisert binding eller tap av positive kloner øke. Ankeret eller dimerization binder utvalget bestå…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av University of Washington Innovation Award (til L.G.), et stipend fra US National Institutes of Health (1R35GM128918 til L.G.), og en oppstart fondet av University of Washington (til L.G.). H.J. ble støttet av en Washington Research Foundation Undergraduate fellesskap. KW ble støttet av et universitets stipend fra University of Washington Institute for protein design.
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |