Fabricage van Ti3C2 MXene Microelectrode Arrays voor In Vivo Neural Recording

Summary

We beschrijven hier een methode voor het fabriceren van Ti₃C₂ MXene micro-elektrode arrays en ze te gebruiken voor in vivo neurale opname.

Abstract

Implanteerbare micro-elektrode technologieën zijn op grote schaal gebruikt om neurale dynamiek op de microschaal op te helderen om een dieper begrip van de neurale onderbouwing van hersenziekten en letsel te krijgen. Aangezien elektroden worden geminiaturiseerd tot de schaal van individuele cellen, beperkt een overeenkomstige stijging van de interfaceimpedantie de kwaliteit van geregistreerde signalen. Bovendien zijn conventionele elektrodematerialen stijf, wat resulteert in een significante mechanische mismatch tussen de elektrode en het omringende hersenweefsel, wat een ontstekingsreactie uitlokt die uiteindelijk leidt tot een verslechtering van de prestaties van het apparaat. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een proces ontwikkeld om flexibele micro-elektroden te fabriceren op basis van Ti₃C₂ MXeen, een recent ontdekt nanomateriaal dat opmerkelijk hoge volumesvochtcapaciteit, elektrische geleidbaarheid, oppervlaktefunctionaliteit en verwerkbaarheid in waterige dispersies bezit. Flexibele arrays van Ti₃C₂ MXeen micro-elektroden hebben opmerkelijk lage impedantie als gevolg van de hoge geleidbaarheid en hoge specifieke oppervlakte van de Ti₃C₂ MXeen films, en ze hebben bewezen uitstekend gevoelig te zijn voor het opnemen van neuronale activiteit. In dit protocol beschrijven we een nieuwe methode voor micropatterning Ti₃C₂ MXeen in micro-elektrodearrays op flexibele polymere substraten en schetsen we het gebruik ervan voor in vivo micro-elektrocorticografie-opname. Deze methode kan gemakkelijk worden uitgebreid tot MXene elektrode arrays van willekeurige grootte of geometrie voor een reeks andere toepassingen in bio-elektronica te creëren en het kan ook worden aangepast voor gebruik met andere geleidende inkten naast Ti₃C₂ MXeen. Dit protocol maakt eenvoudige en schaalbare fabricage van micro-elektroden uit op oplossingen gebaseerde geleidende inkten mogelijk, en maakt het specifiek mogelijk om de unieke eigenschappen van hydrofiele Ti₃C₂ MXeen te benutten om veel van de barrières te overwinnen die de wijdverbreide adoptie van koolstofgebaseerde nanomaterialen voor neurale micro-elektroden op basis van koolstof lang hebben belemmerd.

Introduction

Inzicht in de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan neurale circuits, en hoe hun dynamiek worden veranderd bij ziekte of letsel, is een cruciaal doel voor het ontwikkelen van effectieve therapieën voor een breed scala van neurologische en neuromusculaire aandoeningen. Micro-elektrode technologieën zijn op grote schaal gebruikt om neurale dynamiek op fijne ruimtelijke en temporele schalen op te helderen. Het verkrijgen van stabiele opnames met een hoge signaal-ruisverhouding (SNR) van microschaalelektroden is echter bijzonder uitdagend gebleken. Aangezien de afmetingen van de elektroden worden gereduceerd tot de aanpak van cellulaire schaal, een overeenkomstige stijging van elektrode impedantie degradeert signaalkwaliteit¹. Bovendien hebben talrijke studies aangetoond dat stijve elektroden bestaande uit conventionele silicium en metalen elektronische materialen aanzienlijke schade en ontstekingen in het neurale weefsel produceren, wat hun nut voor langdurige^registratie2^,3,4,5beperkt. Gezien deze feiten is er grote belangstelling voor de ontwikkeling van micro-elektroden met nieuwe materialen die de elektrode-weefsel interface impedantie kunnen verminderen en kunnen worden opgenomen in zachte en flexibele vormfactoren.

Een veelgebruikte methode voor het verminderen van de elektrode-weefsel interface impedantie is het verhogen van het gebied waarover ionische soorten in de extracellulaire vloeistof kunnen interageren met de elektrode, of de “effectieve oppervlakte” van de elektrode. Dit kan worden bereikt door nanopatroon⁶, oppervlakte verruwing⁷, of elektroplating met poreuze additieven^8,9. Nanomaterialen hebben veel aandacht gekregen op dit gebied omdat ze intrinsiek hoge specifieke oppervlaktes en unieke combinaties van gunstige elektrische en mechanische eigenschappen bieden¹⁰. Zo zijn koolstofnanobuisjes gebruikt als coating om elektrodeimpedantie^11,12,^13,grafeenoxide aanzienlijk te verminderen tot zachte, flexibele vrijstaande sondeelektroden¹⁴, en laser-pyrolyseporeus grafeen is gebruikt voor flexibele, lage impedantie micro-elektrocorticografie (micro-ECoG) elektroden¹⁵. Ondanks hun belofte heeft een gebrek aan schaalbare assemblagemethoden de wijdverbreide adoptie van nanomaterialen voor neurale interfacing elektroden beperkt. Met name nanomaterialen op basis van koolstof zijn doorgaans hydrofoob en vereisen dus het gebruik van oppervlakteactieve stoffen¹⁶, superzuren¹⁷of oppervlaktefunctionalisatie¹⁸ om waterige dispersies te vormen voor fabricagemethoden voor^{oplossingsverwerking,}terwijl alternatieve fabricagemethoden, zoals chemische dampdepositie (CVD), doorgaans hoge temperaturen vereisen die onverenigbaar zijn met veel polymere substraten¹⁹,^{20,21 ,22}.

Onlangs is een klasse van tweedimensionale (2D) nanomaterialen, bekend als MXenes, beschreven die een uitzonderlijke combinatie van hoge geleidbaarheid, flexibiliteit, volumetrische capaciteit en inherente hydrofielheid biedt, waardoor ze een veelbelovende klasse van nanomaterialen voor neurale interfacing elektroden²³. MXenen zijn een familie van 2D overgang metaalcarbides en nitriden die het meest worden geproduceerd door selectief etsen van de A-element van gelaagde precursoren. Dit zijn meestal MAX-fasen met de algemene formule M_n+1AX_n, waarbij M een early transition metal is, is A een onderdeel 12−16 element van het periodiek systeem, X is koolstof en/of stikstof, en n = 1, 2 of 3²⁴. Tweedimensionale MXeenvlokken hebben oppervlakteeindigende functionele groepen die hydroxyl (−OH), zuurstof (−O) of fluor (−F) kunnen omvatten. Deze functionele groepen maken MXenen inherent hydrofiel en maken flexibele oppervlaktemodificatie of functionalisatie mogelijk. Van de grote klasse van MXenen, Ti₃C₂ is de meest uitgebreid bestudeerd en gekenmerkt^25,26,27. Ti₃C₂ toont opmerkelijk hogere volumetrische capaciteit (1.500 F/cm³)²⁸ dan geactiveerd grafeen (~60−100 F/cm³)²⁹, carbide-afgeleide koolstof (180 F/cm³)³⁰, en grafeengelfilms (~260 F/cm³)³¹. Bovendien vertoont Ti₃C₂ een extreem hoge elektronische geleidbaarheid (~ 10.000 S/cm)³², en de biocompatibiliteit ervan is aangetoond in verschillende studies^33,34,35,36. De hoge volumetrische capaciteit van Ti₃C_2-films is voordelig voor biologische detectie- en stimulatietoepassingen, omdat elektroden die capacitieve ladingoverdracht vertonen potentieel schadelijke hydrolysereacties kunnen voorkomen.

Onze groep heeft onlangs aangetoond flexibele, dunne-film Ti₃C₂ micro-elektrode arrays, voorbereid met behulp van oplossing verwerkingsmethoden, die in staat zijn het opnemen van zowel micro-elektrocorticografie (micro-ECoG) en intracorticale neuronale spiking activiteit in vivo met hoge SNR³⁶. Deze MXeenelektroden vertoonden een aanzienlijk verminderde impedantie in vergelijking met met grootte afgestemde goud (Au) elektroden, die kunnen worden toegeschreven aan de hoge geleidbaarheid van MXeen en het hoge oppervlak van de elektroden. In dit protocol beschrijven we de belangrijkste stappen voor het fabriceren van vlakke micro-elektrodearrays van Ti₃C₂ MXeen op flexibele paryleen-C substraten en gebruiken ze in vivo voor intraoperatieve micro-ECoG-opname. Deze methode maakt gebruik van het hydrofiele karakter van MXeen, dat het gebruik van oplossingsverwerkingsmethoden mogelijk maakt die eenvoudig en schaalbaar zijn, zonder dat het gebruik van oppervlakteactieve stoffen of superzuren nodig is om stabiele waterige suspensivers te bereiken. Dit gemak van verwerkbaarheid kan een kosteneffectieve productie van MXeene-biosensoren op industriële schalen mogelijk maken, wat een belangrijke beperking is geweest voor de wijdverbreide adoptie van apparaten op basis van andere koolstofnanomaterialen. De belangrijkste innovatie in de elektrodefabricage ligt in het gebruik van een offerpolymerische laag om het MXeen na spin-coating te micropatroon, een methode die is aangepast uit de literatuur over op de oplossing verwerkte poly(3,4-ethyleenoxythiophene):poly(styreensulfonaat) (PEDOT:PSS) micro-elektroden³⁷, maar die niet eerder was beschreven voor het patroon van MXeen. De uitzonderlijke elektrische eigenschappen van Ti₃C₂, in combinatie met de verwerkbaarheid en 2D morfologie maken het een veelbelovend materiaal voor neurale interfaces. In het bijzonder, Ti₃C₂ biedt een route naar het overwinnen van de fundamentele trade-off tussen elektrode geometrische gebied en elektrochemische interface impedantie, een primaire beperkende factor voor micro-schaal elektrode prestaties. Bovendien kan de fabricageprocedure die in dit protocol wordt beschreven, worden aangepast om MXeen-elektrodearrays van verschillende groottes en geometrieën voor verschillende opnameparadigma’s te produceren, en kan deze ook gemakkelijk worden aangepast om andere geleidende inkten naast MXene op te nemen.

Protocol

Alle in vivo procedures in overeenstemming met de National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Pennsylvania. 1. Synthese van Ti3C2 MXeen OPMERKING: De reactieprocedures beschreven in deze sectie zijn bedoeld voor gebruik in een chemische rookkap. Waspassen die in deze procedure zijn opgenomen,…

Representative Results

Voorbeeld van micro-ECoG-gegevens die zijn geregistreerd op een MXene-micro-elektrodearray, wordt weergegeven in figuur 5. Na toepassing van de elektrodearray op de cortex, werden duidelijke fysiologische signalen onmiddellijk zichtbaar op de opname-elektroden, met ongeveer 1 mV amplitude ECoG-signalen die op alle MXene-elektroden verschenen. Krachtspectra van deze signalen bevestigden de aanwezigheid van twee hersenritmes die vaak werden waargenomen bij ratten onder ketamine-dexmedetomidine…

Discussion

De in dit protocol beschreven mxeensynthese- en delaminatieprocedure (HF/HCl/LiCl) is gebaseerd op de MILD etsbenadering die gebruik maakte van een LiF/HCl (in situ HF) etchant medium²⁶. De MILD-benadering zorgt ervoor dat grote Ti₃C₂ vlokken (meerdere μm in zijdelingse grootte) spontaan worden gedelamineerd tijdens het wassen zodra pH ~5−6 is bereikt. In vergelijking met etsen met HF alleen, resulteert dit in materiaal met een hogere kwaliteit en verbeterde materiaaleigen…

Materials

00-90 screw	McMaster-Carr	90910A630	Skull screw around which ground wire is wrapped
128ch stimulation/recording controller	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
175 mL polypropylene (PP) conical centrifuge tubes	Falcon	REF: 352076	Used for washing
18 position 0.5 mm pitch ZIF connector	Molex	505110-1892	Used to interface the flexible Parylene microelectrode array with the PCB adapter board.
18 position dual row male nano-miniature (.025"/.64mm) connector	Omnetics Connector Corporation	A79008-001	Used to interface the PCB adapter board to the recording headstage.
3ML Disposable Plastic Set Transfer Graduated Pipettes	Rienar	Rienar-3ML-20PCS	Used for transferring etchant or MXene solutions
50 mL polyproylene (PP) concial centrifuge tube	Falcon	REF: 352070	Used for washing and size selection
Al etchant Type A	Transene	060-0026000-QT	For removing Al etch mask layer after final Parylene-C etch.
Aluminum Powder, -325 Mesh, 99.5% (metals basis), particle size < 44 µm	Alfa Aesar	CAS: 7429-90-5	Used for MAX synthesis
AutoCAD software	Autodesk Inc.		Design software for drawing photomasks. Free alternatives include DraftSight and LayoutEditor.
Buffered Oxide Etchant 6:1	JT Baker	1178-03	For removing SiO2 layer to expose MXene electrode contacts at the end of the fabrication procedure.
Buprenorphine SR	Wildlife Pharmaceuticals		Analgesia for rat surgery
Centrifuge	Hermle	Benchmark Z 446	Used for washing and size selection
Dexdomitor	Midwest Veterinary Supply	193.13250.3	Anesthesia for rat surgery
Drill burr	Fine Science Tools	19007-07	Burrs for drill
Electric drill	Foredom	K.1070	Micromotor drill for craniotomies
Electron beam evaporator	Kurt J. Lesker Company		Used to evaporate Ti, Au, and SiO2 during fabrication. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Ground wire	A-M Systems	781500	Bare silver wire
Headspace Vial, glass	Supelco	REF: 27298	Used for storing MXene solutions
Hydrochloric acid (12.1N)	Fisher Scientific	CAS: 7647-01-0	Corrosive; etchant material
Hydrofluoric Acid, (48-51% solution in H2O)	Acros	CAS: 7664-39-3	Etchant material
Jupiter II RIE system	March Plasma Systems Inc.		Planar RIE etching system used to etch the Parylene-C using O2 plasma. Most university clean rooms have a comparable planar RIE etching system.
Kapton standard polyimide tape, 1/4"	DuPont		Used to add thickness to the Au bonding pad region of the flexible Parylene microelectrode array for insertion into the ZIF connector.
Ketamine	Hospital of the Univ. of Penn.		Anesthesia for rat surgery
KLA P-7 Stylus Profilometer	KLA Corporation		Used the measure 2D profiles to confirm complete etching through the sacrificial parylene-C layer in step 2.4.2. Most university clean rooms have this or a comparable stylus profilometer tool.
Lithium chloride, 99% for analysis, anhydrous	Acros	CAS: 7447-41-8	Hygroscopic; delamination material
MA6 mask aligner	Karl Suss Microtec AG		Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool.
Micro-90 cleaning solution	International Products Corporation	M-9050-12	Used as the anti-adhesive layer to enable removal of the sacrificial Parylene-C layer to pattern the MXene
NR71-3000p photoresist	Futurrex Inc.	NR71-3000p	Negative photoresist used to define Ti/Au traces and MXene patterns in the devices.
Ophthalmic ointment	Midwest Veterinary Supply	193.63200.3	To prevent corneal drying during surgery
Parylene deposition system	Specialty Coating Systems		Used to evaporate thin conformal films of Parylene-C
Parylene-C dimer	Specialty Coating Systems	980130-c-01lbe	Flexible polymer used as bottom and top passivating layers for the flexible MXene devices
Photomasks (chrome on soda lime glass)	University of Pennsylvania		Our photomasks were produced in the University clean room using a Heidelberg DWL66+ laser writer system, however several vendors manufacture photomasks from provided design files.
Povidone-iodine solution	Medline	MDS093901	To help prevent infection around scalp incision
Printed Circuit Board (PCB)	Advanced Circuits		Used to interface between the MXene electrode array and the measurement electronics such as the potentiostat and the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on the provided design files.
RD6 Developer	Futurrex Inc.	RD6 Developer	Used to develop NR71-3000p negative photoresist following UV exposure
Reference 600 potentiostat	Gamry Instruments		Used to measure the electrodes' impedance to assess quality of the devices
Remover PG	MicroChem Corp.	G050200	Used to remove NR71-3000p following metal deposition to perform lift-off patterning
RHS2000 Stim SPI interface cable	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
RHS2116 amplifier board	Intan Technologies		A component of the neural recording system.
Si wafers	Wafer World	2885	Substrate for fabrication
Spin Coater	Cost Effective Equipment		For coating wafers with resists and applying the Micro-90 and MXene layers. Most university clean rooms have spin coaters.
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 902	For positioning the rat for neurosurgery
Teflon-coated magnetic stir bar	Corning	REF: 1233W95	Used to stir during etching and intercalation
Titanium carbide, 99.5% (metals basis), particle size ~2 µm	Alfa Aesar	CAS: 12070-08-5	Used for MAX synthesis
Titanium powder, -325 mesh, 99% (metals basis), particle size < 44µm	Alfa Aesar	CAS: 7440-32-6	Used for MAX synthesis
Ultrasonic bath sonicator	Reynolds Tech		For removing metal and photoresist particles during lift-off processes to pattern metals.
UV vis spectrophotometer	ThermoScientific	Evolution 201	Used to determine concentration and observe absorption peak
Zetasizer, Particle Size Analysis	Malvern Panalytical	Nano ZS	Used to determine particle lateral size distibution