Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale
Summary
La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.
Abstract
Gli organiidi offrono strutture tissutali tridimensionali auto-organizzanti che riassumono i processi fisiologici nella comodità di un piatto. La ghiandola mammaria murina è composta da due distinti compartimenti cellulari epiteliali, che servono diverse funzioni: l’esterno, il compartimento mioeile contrattile e il compartimento luminoso interno e secretorico. Qui, descriviamo un metodo con cui le cellule che compongono questi compartimenti vengono isolate e poi combinate per studiare i loro contributi individuali di lignaggio alla morfogenesi e differenziazione della ghiandola mammaria. Il metodo è semplice ed efficiente e non richiede sofisticate tecnologie di separazione come lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza. Invece, raccogliamo e digeriamo enzimaticamente il tessuto, seminamo l’epitelio su piatti di coltura tissutale aderenti, e poi usiamo la provadifferenziata per separare il mioepitheal dalle cellule luminali con purezza del 90%. Le cellule vengono poi placcate in una matrice extracellulare dove si organizzano in organoidi bistrato tridimensionali (3D) che possono essere differenziati per produrre latte dopo 10 giorni di coltura. Per testare gli effetti delle mutazioni genetiche, le cellule possono essere raccolte da modelli murini di tipo selvatico o geneticamente modificati, oppure possono essere geneticamente manipolate prima della coltura 3D. Questa tecnica può essere utilizzata per generare organoidi a mosaico che consentono di sapieggiare la funzione genica specificamente nel compartimento luminooso o mioepitele.
Introduction
La ghiandola mammaria (MG) è una struttura epiteliale tubolare simile ad un albero incorporata all’interno di uno stroma ricco di adipociti. L’epitelio duttale bistrato comprende uno strato basale esterno e basale di contratture, cellule mioepiteliali (MyoEC) e uno strato interno di cellule epiteliali luminali e secretorie (LEC), che circondano un lumaro centrale1. Durante l’allattamento, quando i myoEC esterni si contraggono per spremere il latte dai LEC dell’alveolar interno, la MG subisce numerosi cambiamenti che sono sotto il controllo dei fattori di crescita (ad esempio, EGF e FGF) e degli ormoni (ad esempio progne, insulina e prolattina). Questi cambiamenti causano la differenziazione delle strutture specializzate, gli alveoli, che sintetizzano e secernono il latte durante l’allattamento1. L’epitelio mammario può essere manipolato sperimentalmente utilizzando tecniche in cui sia frammenti di tessuto epiteliale, cellule, o anche una singola cellula basale vengono trapiantati in cuscinetti di grasso mammari ospiti, precleared di parenchyma mammario endogeno, e lasciato crescere per ricostituire un intero albero epileliale funzionale2,3,4,5. Il trapianto è una tecnica potente, ma richiede tempo e impossibile se una mutazione si traduce in una prima letalità embrionale (prima dell’E14) che impedisce il salvataggio dell’anlage mammario trapiantabile. Inoltre, i ricercatori desiderano spesso ricercare i ruoli dei due diversi comparti, che derivano da cellule progenitrici soggette a restrizioni di lignaggio. Mentre la tecnologia Cre-lox consente la manipolazione genetica differenziata di myoEC e LEC, questa è anche un’impresa lunga e costosa. Così, fin dagli anni ’50, gli investigatori hanno usato organoidi mammari in vitro come un modo relativamente semplice ed efficiente per affrontare le questioni riguardanti la struttura e la funzione del tessuto mammario6,7.
Nei primi protocolli che descrivono l’isolamento e la coltura delle cellule epiteliali mammarie primarie, i ricercatori hanno scoperto che una matrice di membrana seminterrato (BME), composta da un coagulo di plasma ed estratto di embrione di pollo, era necessaria per frammenti di MG coltivati su un piatto6. Nei decenni successivi, le matrici extracellulari (ECU, collagene e matrice proteica gelatina secreta dalle cellule del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-Swarm) sono state sviluppate per facilitare la coltura 3D e imitare meglio l’ambiente in vivo7,8,9,10. Cellule cullanti in matrici 3D hanno rivelato da molteplici criteri (morfologia, espressione genica e reattività ormonale) che un tale microambiente migliori modelli in vivo fisiologici processi fisiologici9,10,11,12. La ricerca sulle cellule murine primarie ha identificato i fattori di crescita chiave e i morfogeni necessari per la manutenzione prolungata e la differenziazione degli organoidi13. Questi studi hanno posto le basi per il protocollo qui presentato, e per la coltura delle cellule mammarie umane come organoidi 3D, che è ora uno strumento clinico moderno, consentendo la scoperta di farmaci e test farmacologici su campioni di pazienti14. Nel complesso, la coltura organoide mette in evidenza le capacità di auto-organizzazione delle cellule primarie e il loro contributo alla morfogenesi e alla differenziazione.
Presentato qui è un protocollo alla cultura murine epitelia che può essere differenziato in acini di produzione di latte. Una tecnica di prova differenziale viene utilizzata per isolare i MyoEC e i LEC che compongono i due distinti compartimenti delle cellule MG. Queste frazioni cellulari separate possono quindi essere geneticamente manipolate per sovraesprimere o abbattere la funzione genica. Poiché lignaggio-intrinseco, l’auto-organizzazione è una proprietà innata delle cellule epiteliali mammarie15,16,17, ricombinando queste frazioni cellulari permette ai ricercatori di generare organoidi bistrato. Iniziamo digerindo enzimaticamente il tessuto adiposo, e poi incubando i frammenti mammari su un piatto di coltura dei tessuti per 24 h (Figura 1). I frammenti di tessuto si depositano su piatti di polistirolo come frammenti bistrato con la loro organizzazione in vivo: strato mioeelistiale esterno che circonda strati luminali interni. Questa organizzazione cellulare consente l’isolamento dei MyoEC esterni da trypsin-EDTA (0,05%) trattamento per 3-6 min seguito da un secondo giro di trippsina-EDTA (0,05%) trattamento che stacca i restanti LEC interni (Figura 2). Pertanto, questi tipi di cellule con diversa sensibilità alla trypsina sono isolati e possono essere successivamente miscelati e placcati in ECM (Figura 3). Le cellule si sottopono all’auto-organizzazione per formare sfere a scansione, che comprendono uno strato esterno di MyoEC che circondano i LEC interni. La formazione del lume si verifica quando le cellule crescono in un mezzo contenente un cocktail di fattori di crescita (vedi ricette per Mezzo di crescita)13. Dopo 5 giorni, gli organoidi possono essere differenziati in acini che producono latte passando all’Alveologenesi Medium (vedi ricette e Figura 3F)e incubati per altri 5 giorni. In alternativa, gli organoidi continueranno ad espandersi e a ramificarsi in Growth Medium per almeno 10 giorni. Gli organiidi possono essere analizzati utilizzando l’immunofluorescenza (Figura 3D-F) o rilasciati dall’ECM utilizzando una soluzione di recupero (cfr. tabella dei materiali)e analizzati tramite altri metodi (ad esempio, immunoblot, RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui viene presentato un metodo che descrive in dettaglio come i ricercatori possono generare colture organoidi 3D utilizzando cellule MG primarie. La differenza tra questo e altri protocolli è che dettagliamo un metodo per separare i due compartimenti cellulari MG distinti: i MyoEC basali esterni e i LEC interni. Il nostro metodo impiega una trypsin-EDTA in due fasi (0,05%) trattamento che chiamiamo metapsinizzazione differenziale19. Questa procedura consente ai ricercatori di isolare myinfo e LE…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Ben Abrams per l’assistenza tecnica e il supporto di base dell’Istituto per la biologia delle cellule staminali (IBSC) dell’Università della California (UCSC). Ringraziamo Susan Strome e Bill Saxton per l’uso del loro Microscopio Solamere Spinning Disk Confocal. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni all’UCSC dall’Howard Hughes Medical Institute attraverso il programma James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study (S.R.), dal NIH (NIH GM058903) per l’iniziativa di massimizzare lo sviluppo degli studenti (H.M.) e da la National Science Foundation for a graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) e con una sovvenzione (A18-0370) del Comitato di coordinamento della ricerca UC-Cancro (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
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