Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung
Summary
Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.
Abstract
Organoide bieten selbstorganisierende, dreidimensionale Gewebestrukturen, die physiologische Prozesse in der Bequemlichkeit einer Schale rekapitulieren. Die murine Brustdrüse besteht aus zwei unterschiedlichen Epithelzellfächern, die verschiedene Funktionen erfüllen: das äußere, kontraktile myoepitheliale Fach und das innere, sekretorische Luminalfach. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der die Zellen, die diese Kompartimente bilden, isoliert und dann kombiniert werden, um ihre individuellen Abstammungsbeiträge zur Brustdrüsenmorphogenese und Differenzierung zu untersuchen. Die Methode ist einfach und effizient und erfordert keine ausgeklügelten Trenntechnologien wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Stattdessen ernten und verdauen wir das Gewebe enzymatisch, säen das Epithel auf anhaftenden Gewebekulturgerichten und verwenden dann die Differential-Trypsinisierung, um Myoepithel von Leuchtzellen mit einer Reinheit von 90 % zu trennen. Die Zellen werden dann in einer extrazellulären Matrix plattiert, wo sie sich in zweischichtige, dreidimensionale (3D) Organoide organisieren, die differenziert werden können, um Milch nach 10 Tagen in der Kultur zu produzieren. Um die Auswirkungen genetischer Mutationen zu testen, können Zellen aus Wildtyp- oder gentechnisch veränderten Mausmodellen geerntet oder vor der 3D-Kultur genetisch manipuliert werden. Diese Technik kann verwendet werden, um Mosaik-Organoide zu erzeugen, die die Untersuchung der Genfunktion speziell im Luminal- oder Myoepithelfach ermöglichen.
Introduction
Die Brustdrüse (MG) ist eine baumartige, röhrenförmige Epithelstruktur, die in eine adipozytenreiche Stroma eingebettet ist. Das zweischichtige duktale Epithel besteht aus einer äußeren, basalen Schicht aus kontraktilen, myoepithelialen Zellen (MyoECs) und einer inneren Schicht aus luminalen, sekretorischen Epithelzellen (LECs), die ein zentrales Lumenumschließen 1. Während der Stillzeit, wenn sich die äußeren MyoECs zusammenschließen, um Milch aus den inneren alveolarLECs zu pressen, erfährt das MG zahlreiche Veränderungen, die unter der Kontrolle von Wachstumsfaktoren (z. B. EGF und FGF) und Hormonen (z. B. Progesteron, Insulin und Prolaktin) stehen. Diese Veränderungen verursachen die Differenzierung von spezialisierten Strukturen, Alveolen, die Milch während der Laktation1synthetisieren und absondern. Die Brustepithelie kann experimentell mit Techniken manipuliert werden, bei denen entweder Epithelgewebefragmente, Zellen oder sogar eine einzelne Basalzelle in Brustfettpolster transplantiert, von endogenem Brustparenchym vorgereinigt und auswachsen lassen, um einen ganzen, funktionellen Epithelbaum2,3,4,5zu rekonstruieren. Transplantation ist eine leistungsfähige Technik, aber es ist zeitaufwändig und unmöglich, wenn eine Mutation zu einer frühen embryonalen Letalität (vor E14) führt, die die Rettung von transplantierbaren Brustanlagen verhindert. Darüber hinaus möchten die Forscher häufig die Rollen der beiden verschiedenen Kompartimente erforschen, die aus linienbeschränkten Vorläuferzellen abgeleitet sind. Während die Cre-lox-Technologie die differenzielle genetische Manipulation von MyoECs und LECs ermöglicht, ist dies auch ein zeitaufwändiges und teures Unterfangen. So haben die Forscher seit den 1950er Jahren In-vitro-Mammariide als relativ einfache und effiziente Möglichkeit verwendet, Um Fragen zur Brustgewebestruktur und -funktion6,7zu beantworten.
In frühen Protokollen, die die Isolierung und Kultur der primären Epithelzellen der Brust beschreiben, fanden die Forscher heraus, dass eine Kellermembranmatrix (BME), bestehend aus einem Plasmagerinnsel und Einem Hühnerembryonalextrakt, für MG-Fragmente erforderlich war, die auf einer Schale6angebaut wurden. In den folgenden Jahrzehnten wurden extrazelluläre Matrizen (ECMs, Kollagen und geleeartige Proteinmatrix, die von Engelbreth-Holm-Swarm-Murine-Sarkomzellen sezerniert wurden) entwickelt, um die 3D-Kultur zu erleichtern und die in vivo-Umgebung7,8,9,10” besser nachzuahmen. Culturing Zellen in 3D-Matrizen durch mehrere Kriterien (Morphologie, Genexpression und Hormonreaktion) offenbart, dass eine solche Mikroumgebung besser Modelle in vivo physiologische Prozesse9,10,11,12. Die Forschung mit primären murinen Zellen identifizierte wichtige Wachstumsfaktoren und Morphogene, die für die erweiterte Erhaltung und Differenzierung von Organoiden notwendig sind13. Diese Studien haben die Voraussetzungen für das hier vorgestellte Protokoll und für die Kultur menschlicher Brustzellen als 3D-Organoide bereitet, die heute ein modernes klinisches Werkzeug ist, das die Entdeckung von Arzneimitteln und Arzneimitteltests an Patientenprobenermöglicht 14. Insgesamt hebt die organoide Kultivierung die Selbstorganisationskapazitäten von Primärzellen und ihre Beiträge zur Morphogenese und Differenzierung hervor.
Präsentiert hier ist ein Protokoll zu Kultur murin epithelia, die in Milch produzierenden Acini unterschieden werden kann. Eine differenzielle Trypsinisierungstechnik wird verwendet, um die MyoECs und LECs zu isolieren, aus denen die beiden unterschiedlichen MG-Zellkompartimente bestehen. Diese getrennten Zellfraktionen können dann genetisch manipuliert werden, um die Genfunktion zu überexpressen oder zu klopfen. Da die Linienintrinsinin, die Selbstorganisation eine angeborene Eigenschaft der Epithelzellen der Brust15,16,17ist, ermöglicht die Rekombination dieser Zellfraktionen den Forschern, bilayerierte Mosaik-Organoide zu erzeugen. Wir beginnen damit, das Fettgewebe enzymatisch zu verdauen und dann die Brustfragmente auf einer Gewebekulturschale für 24 h zu inkubieren (Abbildung 1). Die Gewebefragmente setzen sich auf Polystyrolschalen als zweischichtige Fragmente mit ihrer In-vivo-Organisation ab: äußere myoepitheliale Schicht, die innere Luminalschichten umgibt. Diese zelluläre Organisation ermöglicht die Isolierung der äußeren MyoECs durch Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung für 3-6 min gefolgt von einer zweiten Runde Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung, die die verbleibenden inneren LECs löst (Abbildung 2). Somit werden diese Zelltypen mit unterschiedlicher Trypsinempfindlichkeit isoliert und können anschließend in ECM gemischt und plattiert werden (Abbildung 3). Die Zellen durchlaufen eine Selbstorganisation, um zweischichtige Kugeln zu bilden, die eine äußere Schicht von MyoECs umgeben, die innere LECs umgeben. Lumenbildung tritt auf, wenn die Zellen in einem Medium wachsen, das einen Cocktail von Wachstumsfaktoren enthält (siehe Rezepte für Growth Medium)13. Nach 5 Tagen können Organoide durch Umschalten auf Alveologenese Medium (siehe Rezepte und Abbildung 3F)in milchproduzierende Acini differenziert und für weitere 5 Tage inkubiert werden. Alternativ werden Organoide für mindestens 10 Tage weiter expandieren und in Growth Medium verzweigen. Organoide können mit Immunfluoreszenz (Abbildung 3D-F) analysiert oder aus dem ECM mit einer Wiederherstellungslösung freigesetzt werden (siehe Materialtabelle) und mit anderen Methoden (z. B. Immunoblot, RT-qPCR) analysiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird eine Methode vorgestellt, die detailliert darlegen, wie Forscher 3D-Organoidkulturen mit primären MG-Zellen erzeugen können. Der Unterschied zwischen diesem und anderen Protokollen besteht darin, dass wir eine Methode zur Trennung der beiden unterschiedlichen MG-Zellkompartimente detailliert beschreiben: die äußeren basalen MyoECs und die inneren LECs. Unsere Methode verwendet eine zweistufige Trypsin-EDTA (0,05%) Behandlung, die wir Differential-Trypsinisierung19nennen. Dieses Verfa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ben Abrams für die technische Unterstützung und Die Kernunterstützung des University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for the Biology of Stem Cells (IBSC). Wir danken Susan Strome und Bill Saxton für den Einsatz ihres Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Diese Arbeit wurde teilweise durch Stipendien an die UCSC vom Howard Hughes Medical Institute durch das James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study Program (S.R.), vom NIH (NIH GM058903) für die Initiative zur Maximierung der Studentenentwicklung (H.M.) und von der die National Science Foundation für ein Graduiertenforschungsstipendium (O.C. DGE 1339067) und durch ein Stipendium (A18-0370) des UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
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